[发明专利]一种提高EGF91在重组毕赤酵母中表达效率的方法

摘要

本发明提供了一种提高EGF91在重组毕赤酵母中表达效率的方法，其包括如下步骤(1)扩增EGF91基因、酶切；(2)将酶切产物分离后回收、连接反应；(3)连接反应后转化至E.coli DH5α感受态细胞，提取阳性转化子质粒，获得重组表达载体；(4)转化毕赤酵母，得到重组菌株；(5)酶切、扩增pfu‑sHSP基因，用Nhel和Spel进行双酶切；(6)分离、回收酶切产物，进行连接反应；(7)转化至E.coli DH5α感受态细胞，提取阳性转化子质粒，获得重组表达载体；(8)将表达载体导入菌株中，获得重组酵母；(9)接种、培养重组酵母。本发明的方法能够提高EGF的表达量。

主权项

一种提高EGF91在重组毕赤酵母中表达效率的方法，其包括如下步骤：(1)以EGF91基因序列为模板，在基因两端加入NheI和SpeI的限制性酶切位点，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，将得到的PCR产物纯化后和质粒PJ902‑15分别用Nhel和Spel进行双酶切；(2)将步骤(1)得到的酶切产物经琼脂凝胶电泳分离后回收，回收产物进行连接反应；(3)连接反应后转化至E.coli DH5α感受态细胞，提取阳性转化子质粒，分别进行酶切鉴定和测序鉴定，获得重组表达载体；(4)将步骤(3)得到的重组表达载体转化毕赤酵母，得到重组菌株Pichia pastoris X33‑EGF91；(5)以pfu‑sHSP基因序列为模板，在基因两端加入NheI和SpeI的限制性酶切位点，设计第二对特异性引物，进行PCR扩增，将得到的PCR产物纯化后和质粒PJ902‑15分别用Nhel和Spel进行双酶切；(6)将步骤(5)得到的酶切产物经琼脂凝胶电泳分离后回收，回收产物进行连接反应；(7)连接反应后转化至E.coli DH5α感受态细胞，提取阳性转化子质粒，分别进行酶切鉴定和测序鉴定，获得重组表达载体；(8)将步骤(7)得到的pfu‑sHSP的表达载体导入到步骤(4)中得到的Pichia pastoris X33‑EGF91菌株中，获得重组酵母Pichia pastoris X33‑EGF91‑sHSP；(9)将所述重组酵母Pichia pastoris X33‑EGF91‑sHSP接种于BMGY培养基，静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段接种于诱导表达培养基中；(10)28℃、250r/min振荡培养，每24h补加甲醇至体积分数1％，总诱导时间72h；(11)离心收取上清液进行Tricine‑SDS‑PAGE电泳，筛选表达量高的重组毕赤酵母作为工程菌。