[发明专利]一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法，包括以下步骤a.收集细胞；b.细胞匀浆裂解；c.细胞核的制备；d.细胞染色质及其相关蛋白的分离；e.染色质相关蛋白的检测。使用本发明所述方法能够获得纯度较高的染色质及其相关蛋白，不含有胞浆和胞膜成分。本方法解决了目前从组织或细胞全裂解液中分离提取染色质及其相关蛋白比较困难的问题，为染色质及其相关蛋白的功能研究提供了实验基础，具有广阔的应用前景。

主权项

一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：a. 收集细胞弃去培养液，使用稀释后的0.25%的胰酶溶液进行常规细胞消化，离心弃上清，保留细胞沉淀，用适量PBS重悬细胞沉淀，离心弃上清，保留沉淀；b. 细胞匀浆裂解（1）向步骤a所得沉淀中加入buffer 1，震荡后冰浴2‑5分钟；（2）将细胞悬液转移到预冷的玻璃匀浆器内，冰上匀浆50‑60次左右后冰上静置1‑2 h；（3）600‑900g，4℃离心5‑10分钟，得到的沉淀即粗细胞核组分；（4）吸取步骤b（3）所得上清，600‑900g，4℃，5‑10分钟，反复多次离心，直至没有沉淀，最终得到的上清即为胞浆和胞膜的混合组分；c. 细胞核的制备用适量buffer 1重悬步骤b（3）得到的粗核，离心弃上清；重复上述离心过程4‑5次，最终得到的沉淀即为完整且纯度较高的细胞核组分；d. 细胞染色质及其相关蛋白的分离（1）用适量的buffer 2溶解细胞核组分，冰浴30‑60 min，离心，获得沉淀和上清，上清即为核内可溶性组分；（2）将步骤d（1）得到的沉淀用buffer 2重悬，离心，弃去上清，重复离心2‑3次，最终得到的沉淀即为细胞核内不溶性的染色质组分；e. 染色质相关蛋白的检测（1）胞浆和胞膜的混合组分以及核内可溶性组分：根据上清体积加1/3体积的三氯醋酸水溶液，‑20℃过夜；第二天取出，4000‑5000g，4℃离心5‑10分钟，弃上清，冰上干燥后加入1×SDS细胞裂解液，4℃裂解蛋白；（2）细胞核组分以及细胞核内不可溶性的染色质及其相关蛋白组分：直接加入1×SDS细胞裂解液，4℃裂解蛋白；上述组分蛋白裂解后加热变性，测蛋白浓度，进行Western blot检测。