[发明专利]一种人表皮细胞的差别消化方法

摘要

本发明公开了一种人表皮细胞的差别消化方法，具体涉及组织细胞学领域。已去除皮下疏松结缔组织的人表皮组织经D‑H酶消化液消化；消化完成后加入血清终止液，过滤收集至离心管；倾出上清后用PBS轻柔吹打至细胞悬液完全混匀，分别取上半部分与下半部分适量悬液滴入不同的EP管，进行细胞计数并检测细胞活力；离心后接种至表皮细胞培养液，经37℃5%CO2培养箱培养获得表皮细胞。该方法简单，快速，获取细胞数量多且纯度高，可建立活力较高的人表皮细胞库，供临床移植和体外重建人体皮肤模型所需。

主权项

一种人表皮细胞的差别消化方法，其特征在于，所述人表皮细胞的差别消化方法包括如下几个步骤：（1）在超净台中预备无菌玻璃培养皿，一个中加入10mL75%乙醇，三个中各加入10mL无菌PBS，将新鲜人皮肤组织浸入75%乙醇溶液30s，期间将真皮面卷曲部分铺开使其充分接触乙醇以去除血污，减少表面污染；（2）将无菌处理后的组织转入PBS溶液中浸洗，1min后转入另一PBS皿中继续清洗至无血污，后将组织表皮面向下展于平皿中，去除皮下疏松结缔组织，暴露致密结缔组织，直至组织块不再卷曲，此过程不超过10min，完成后转入新鲜PBS中浸洗；（3）表皮面向下，将组织切割成为0.2~2cm2的大小；（4）将切割好的组织块转入25mL血清瓶中，每块组织添加1mL D‑H酶消化液，消化液需完全浸没组织块，盖好瓶盖用封口膜封口后置入4℃冰箱，轻晃血清瓶使组织均匀分散于底部，消化8~10h，该消化过程避光；（5）浸泡过后的组织连同D‑H酶消化液一同倾入无菌玻璃培养皿中，表皮面呈褐色，用镊子将表皮撕下，收集放入预备好的50mL原代消化液中，转至37℃二氧化碳培养箱中，消化10 min，每2min震荡一次；（6）消化完成后，每个25mL消化瓶中加入10mL血清终止液，并吹打50次，后过200目网筛，滤液收集入50mL离心管中，血清瓶也加入血清终止液过滤收集至离心管，800rpm离心6 min；（7）离心后倾出上清，用PBS轻柔吹打细胞，上吸下打（6秒每次），待沉淀吹散后下吸上打6~8次（2秒每次）至细胞悬液完全混匀，再根据沉淀量补加PBS，使用弯头吸管吹打2~3次（2秒每次），从细胞悬液的上半部分与下半部分各取适量悬液滴入不同的1.5mLEP管中，加入计数板中进行细胞计数，用台盼蓝染色，检测细胞活力，盖上离心管后离心，800rpm，离心6min；（8）根据计数结果，按照3.5E6/瓶进行接种，每瓶10mL表皮细胞培养液，将培养瓶瓶口向内水平置于37℃ 5% CO2培养箱中进行培养；（9）获得的表皮细胞经Western blotting蛋白质检测表皮细胞生长因子表达水平，经灰度分析结果显示其灰度值达到9000以上。