[发明专利]一种小鼠体细胞核移植方法

摘要

本发明公开了一种优化的小鼠体细胞核移植方法，利用卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞这3种细胞构建了重构胚，并比较了这3种重构胚在不同激活液中的激活效率，在不同溶液中的发育效率，采用不同胚胎移植方法的妊娠效率；得出，无钙KSOM激活液是通用的高效激活液，激活效率在93.5％左右；KSOM‑AA培养液适合于卵丘和胚胎干细胞重构胚的体外培养，胎儿成纤维重构胚的最佳培养液为αMEM培养液；当重构胚体外发育至2‑细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎可高效获得核移植动物；本发明的方法能提高重构胚卵裂率和囊胚发育率、克隆动物出生率和成活率，继而提高从重构囊胚中获得胚胎干细胞的成功率。

主权项

一种小鼠体细胞核移植方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选择实验动物：选用B6D2F1雌雄小鼠提供稳定的卵母细胞；2)配制细胞培养液：2.1)饲养层细胞培养液：500mL，组成成分为：DMEM培养液445mL、牛血清e)50mL、L‑谷氨酰胺5mL；2.2)胚胎干细胞养出培养液：100mL，组成成分为：DMEM培养液80mL、血清替代物15mL、青链霉素混合液1ml、L‑谷氨酰胺1ml、非必须氨基酸1ml、胚胎干细胞核苷酸1ml、β巯基乙醇100μl、白血病抑制因子10μl；2.3)冻存液：500mL，组成成分为：DMEM培养液350mL、血清50mL、L‑谷氨酰胺100mL；配完后10mL分装，‑20℃保存，有效期12个月，用于细胞的冻存；2.4)丝裂霉素C：100X丝裂霉素C的配置与储存均在生物安全柜中进行，用2mL注射器吸取2mL的血清注入2mg丝裂霉素C棕色药瓶中，充分颠倒混匀后配置成1mg/mL浓储液，开瓶盖，将溶解后的丝裂霉素C分装，存于‑20℃中，丝裂霉素C的工作浓度为10μg/mL。3)配制胚胎培养液：3.1)浓缩液：3.1.1)HCZB浓储液：500mL；组成成分为：超纯水495ml、氯化钠2380mg、氯化钾180mg、7水硫酸镁145mg、乙二胺四乙酸二钠20mg、乳酸钠2.65mL、葡萄糖500mg、磷酸二氢钾80mg；3.1.2)10ml氯化钙100X浓储液：由0.2g二水氯化钙和10ml超纯水配制而成；3.1.3)10ml氯化锶100X浓储液：由2.666g六水氯化锶和10ml超纯水配制而成；3.1.4)20ml谷氨酰胺100X浓储液：由0.294g谷氨酰胺和20ml无钙CZB溶液配制而成；3.1.5)细胞松弛素B溶液：由细胞松弛素B以1mg/ml的配比溶于二甲基亚砜溶液中制备而成；3.1.6)聚乙烯吡咯烷酮溶液：质量分数为10％的PVP溶液：由1g PVP和10ml HCZB配制而成；质量分数为3％的PVP溶液：由0.3g PVP和10ml HCZB配制而成；3.1.7)透明质酸酶10X浓储液：由20ml M2培养液和100mg透明质酸酶配制而成；3.2)HCZB胚胎操作液：100ml，pH＝7.4；组成：步骤3.1.1)中制备的HCZB浓储液99ml；碳酸氢钠211mg、步骤3.1.2)中制备的二水氯化钙100X浓储液1ml、丙酮酸钠3mg、谷氨酰胺1ml、牛血清白蛋白500mg；3.3)无钙CZB溶液：组成：步骤3.1.1)中制备的HCZB浓储液100ml、碳酸氢钠211mg、丙酮酸钠3mg、谷氨酰胺1ml、牛血清白蛋白500mg；3.4)M2胚胎操作液3.4.1)M2、M16浓储液浓储液A(10×)200mL；组成：氯化钠11.068g、氯化钾0.712g、磷酸二氢钾0.324g、7水硫酸镁0.586g、乳酸钠8.698g、葡萄糖2g、青霉素0.12g、链霉素0.1g；浓储液B(10×)20mL；组成：碳酸氢钠0.4202g、酚红0.002g；浓储液C(100×)10mL；组成：丙酮酸钠0.036g；浓储液D(100×)50mL；组成：二水氯化钙1.26g；浓储液E(100×)250ml；组成：4‑2‑羟乙基‑1‑哌嗪乙磺酸14.895g、酚红0.025g。3.4.2)从浓储液配制M2培养液M2培养液体积10mL：浓储液A(10×)1.00mL、浓储液B(10×)0.16mL、浓储液C(100×)0.10mL、浓储液D(100×)0.10mL、浓储液E(100×)0.84mL、无酶水7.80mL、牛血清白蛋白40mg；M2培养液体积50mL：浓储液A(10×)5.00mL、浓储液B(10×)0.80mL、浓储液C(100×)0.50mL、浓储液D(100×)0.50mL、浓储液E(100×)4.20mL、无酶水39.0mL、牛血清白蛋白200mg；M2培养液体积100mL：浓储液A(10×)10.0mL、浓储液B(10×)1.60mL、浓储液C(100×)1.00mL、浓储液D(100×)1.00mL、浓储液E(100×)8.40mL、无酶水78.0mL、牛血清白蛋白400mg；M2培养液体积200mL：浓储液A(10×)20.0mL、浓储液B(10×)3.20mL、浓储液C(100×)2.00mL、浓储液D(100×)2.00mL、浓储液E(100×)16.80mL、无酶水156.0mL、牛血清白蛋白800mg；3.4.3)从浓储液配制M16培养液M6培养液体积10mL：浓储液A(10×)1.00mL、浓储液B(10×)1.00mL、浓储液C(100×)0.10mL、浓储液D(100×)0.10mL、无酶水7.80mL、牛血清白蛋白40mg；M6培养液体积50mL：浓储液A(10×)5.00mL、浓储液B(10×)5.00mL、浓储液C(100×)0.50mL、浓储液D(100×)0.50mL、无酶水39.0mL、牛血清白蛋白200mg；M6培养液体积100mL：浓储液A(10×)10.00mL、浓储液B(10×)10.00mL、浓储液C(100×)1.0mL、浓储液D(100×)1.0mL、无酶水78.0mL、牛血清白蛋白400mg；M6培养液体积200mL：浓储液A(10×)20.00mL、浓储液B(10×)20.00mL、浓储液C(100×)2.0mL、浓储液D(100×)2.0mL、无酶水156.0mL、牛血清白蛋白800mg；3.5)配制KSOM‑AA胚胎培养液每100mLKSOM‑AA胚胎培养液中含乙二胺四乙酸二钠盐0.38mg、氯化钠559.5mg、氯化钾18.5mg、磷酸二氢钾4.75mg、7水硫酸镁4.95mg、乳酸钠盐溶液0.174ml、葡萄糖3.60mg、碳酸氢钠210.0mg、谷氨酰胺14.5mg、丙酮酸钠2.2mg、青霉素6.3mg、链霉素5.0mg；必需氨基酸1.0ml、非必需氨基酸0.5ml；其中乙二胺四乙酸二钠盐优先滴加，将100mg牛血清白蛋白添加到100mLKSOM‑AA胚胎培养液中，轻轻混匀使牛血清白蛋白缓慢溶解，不要剧烈摇动液体以避免产生泡沫而导致蛋白质变性；用0.22μm的针头式滤器过滤培养液到无菌的塑料管内，溶液保存在4℃，保存时间1～2周；4)实验器材：4.1)核移植实验器材：Corning塑料培养皿、充油型注射仪、带有Nomarski或Hoffman光学系统的倒置显微镜、锻针仪、压电陶瓷系统、拉针仪、显微操作用针、水银；4.2)细胞培养实验器材：1.5ml、0.6ml和0.2ml离心管；细胞培养皿、离心管、冻存管；细胞培养用移液管；离心机；体式镜；培养箱；生物安全柜；5)实验方法：5.1)准备供体细胞：5.1.1)制备小鼠饲养细胞；5.1.2)制备胚胎干细胞；5.1.3)制备胎儿成纤维细胞；5.2)体细胞核移植：5.2.1)收集MⅡ期卵母细胞；5.2.2)准备供体细胞：包括胚胎干细胞收集、MEF细胞收集、卵丘细胞的收集；5.3)进行核移植操作：包括：准备显微操作用的操作滴、MII卵母细胞的去核、供体核注射、重构胚的激活、重构胚体外培养；5.4)胚胎移植：5.4.1)准备结扎雄鼠与假孕雌鼠；5.4.2)进行输卵管伞口移植；5.4.3)进行子宫角移植；6)进行数据统计和分析：采用SPSS10.0统计学软件分析处理，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著；6.1)选取最佳激活液：将卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚分别用无钙CZB、无钙KSOM激活6h后统计假原核形成率；得到无钙KSOM激活液为最佳激活液；于体式镜下统计重构胚的状况，卵丘细胞重构胚经无钙KSOM激活后，成功率为93.5％，成功率极显著，优于无钙CZB激活液，P<0.01；对于胎儿成纤维细胞重构胚和ES重构胚，两种激活液的激活效果差异不显著，P>0.05，但这两种重构胚经无钙KSOM激活后死亡率显著低于无钙CZB激活液，P<0.05，表明，无钙KSOM激活液是最好的小鼠重构胚激活液；6.2)选取重构胚培养液：采用步骤6.1)确定的无钙KSOM激活液，将激活后的卵丘细胞重构胚、胎儿成纤维细胞重构胚和胚胎干细胞重构胚分别用CZB、αMEM、M16和KSOM‑AA培养液培养，4.5d后比较重构胚的囊胚发育率；得到KSOM‑AA液作为重构胚培养液；在这4种培养液中，卵丘细胞重构胚均有较高的卵裂率，囊胚发育率也很高；卵丘细胞重构胚的卵裂率在4种胚胎培养液中无差异，但在KSOM‑AA培养液中囊胚率最高，为78.4％；在αMEM中，胎儿成纤维细胞重构胚的卵裂率显著高于其它培养液，在KSOM‑AA培养液中胎儿成纤维细胞重构胚的囊胚率显著高于αMEM培养液，αMEM和KSOM‑AA培养液相比较为37.1vs.30.2％，P<0.05；胚胎干细胞重构胚在KSOM‑AA培养液中卵裂率和囊胚率均显著高于其它3种培养液，在所用的4种培养液中，KSOM‑AA对三类克隆胚胎的培养效果最好，因此在克隆操作中，均选用KSOM‑AA培养液作为重构胚培养液；6.3)选取最佳胚胎移植方法采用步骤6.1)确定的无钙KSOM激活液和步骤6.2)确定的KSOM‑AA培养液，将卵丘细胞重构胚通过输卵管移植法和子宫移植法进行胚胎移植，统计核移植小鼠的出生率；卵丘细胞重构胚经无钙KSOM激活液激活6h后，将形态良好并且形成假原核的重构胚，于KSOM‑AA培养液中培养，培养12h后，将卵裂胚采用输卵管移植；培养3.5d后发育至囊胚的重构胚进行子宫角移植；统计小鼠出生情况采用输卵管移植时，每侧移植2‑细胞时期重构胚15枚；子宫角移植时，每侧子宫角移植7枚囊胚；子宫角移植组无一发育到期，而输卵管移植组有1只孕鼠发育到期，并生下1仔，出生率1.67％，得出，重构胚体外发育至MⅡ期细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎获得核移植动物效率高。