[发明专利]一种通过酶切基因组构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库的方法

摘要

一种通过酶切基因组构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库的方法，涉及一种基因组敲除文库的构建方法。是要解决现有敲除文库构建方法存在物种基因信息不完善、人工设计覆盖度低且耗时耗力的问题。方法一、构建Mspl.f‑library文库；二、获得20bp gRNA靶序列片段；三、构建PAM‑f.library文库；四、Lenti‑gRNA‑library文库构建。本发明获得gRNA文库的方法不依赖于已知物种基因组序列信息，避免了物种基因信息不完善、人工设计覆盖度低且耗时耗力等缺点，大大提高敲除文库的覆盖率。本发明用于构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库。

主权项

一种通过酶切基因组构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、构建Mspl.f‑library文库1)构建C1‑f.MspI‑MmeI载体：通过基因合成的方式合成含有AclI、MmeI、MlyI三个限制性内切酶识别位点的正向引物和反向引物，正向引物名称为C1‑f.MspI‑MmeI‑Anneal‑F,序列为：5’‑CATGTGAGTCCAACGTTGGACTCG‑3’，反向引物名称C1‑f.MspI‑MmeI‑Anneal‑R,序列为：5’‑GATCCGAGTCCAACGTTGGACTCA‑3’；将两条引物单体通过退火形成具有粘性末端的双链DNA，该DNA片段的两粘性末端恰好与PciI和BamHI酶切后的切口相同；对pEGFP‑C1质粒进行PciI和BamHI双酶切，并与退火后的双链DNA进行连接，即形成含有两个MmeI酶切位点、一个AclI酶切位点和两个MlyI酶切位点的C1‑f.MspI‑MmeI载体；2)以待研究的基因组DNA为模板，采用MspI进行酶切，将C1‑f.MspI‑MmeI载体经AclI酶切，两个酶切产物进行连接，获得Mspl.f‑library文库；二、获得19bp gRNA靶序列片段1)使用含有生物素标记的引物对C1‑f.MspI‑A&Bio‑F/R，引物C1‑f.MspI‑A&Bio‑F，序列为5’‑GGGTTTCGCCACCTCTGACTTG‑3’，以及引物C1‑f.MspI‑A&Bio‑R，序列为5’‑GCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGG‑3’；以Mspl.f‑library为模板，进行PCR扩增，扩增产物为长度不等的、并且两端均含有生物素标记的DNA片段，该片段包括MmeI、MlyI酶切识别位点以及MspI消化基因组后的产物片段；2)对步骤二中1)得到的PCR产物进行MmeI酶切，得到含有生物素标记的酶切产物，通过链霉亲和素包被的磁珠对含有生物素标记的酶切产物进行吸附，此时磁珠吸附的片段包括MlyI酶识别位点及19bp靶序列片段；3)然后对磁珠使用MlyI进行酶切，即19bp靶序列片段切割分离，游离于上清液中，对液相部分进行回收，所获得的19bp靶序列片段存在于液相；三、构建PAM‑f.library文库通过基因合成的方式合成U6启动子，以及guideRNA结构序列并连入pEGFP‑C1载体中KpnI与EcoRI位点之间，获得PAM‑F载体，将步骤二所获得的19bp gRNA靶序列片段连入PAM‑F载体中，对PAM‑F载体进行BbsI内酶切酶切，酶切产物进行补平并磷酸化，产生的平末端用于接纳17/19bpguideRNA片段的平末端；补平后进行BsrDI内切酶酶切，酶切获得共计16种不同的两碱基突出末端用于接纳17/19bpguideRNA片段的粘性末端，将酶切后的载体与步骤二中得到的17/19bpguideRNA片段进行连接，获得PAM‑f.library文库；U6启动子的5’端具有KpnI内切酶酶切位点，3’端具有BsrDI内切酶识别位点以及切割位点，能够产生2bp的突出端，U6启动子的序列如下：GGTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCNNCATTGC；guideRNA结构序列的5’端具有BbsI内切酶识别及酶切位点，3’端具有EcoRI内切酶酶切位点，guideRNA结构序列如下：GAAGACAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGAATTC；四、Lenti‑gRNA‑library文库构建对PAM‑f.library文库进行EcoRI‑KpnI双酶切，获得U6‑guideRNA片段，将U6‑guideRNA片段连入慢病毒质粒lentiCRISPRv2载体中，最终构建获得Lenti‑gRNA‑library文库。