[发明专利]采用ddPCR方法鉴定PML‑RARα融合基因中的Brc3亚型

摘要

本发明公开了一种采用ddPCR方法鉴定PML‑RARα融合基因中的Brc3亚型，该ddPCR方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估和RNA反转录cDNA并进行QC评估。本发明针对常见的Brc3型，设计检测fusion探针，引物针对fusion两侧序列进行扩增；将RARΑ基因作为内参，设计Ref探针，引物仅扩增RARΑ基因。本发明中的ddPCR检测方法PML‑RARα融合bcr3亚型可达0.01%的丰度，远超RT‑PCR的0.1%，重复性好，无假阳性；在低AF的情况下，建议样本投入量增加，或重复多个平行操作。由于该技术的高灵敏度，因此可应用于疾病的早期确诊、动态监测和防治复发。

主权项

一种采用ddPCR方法鉴定PML‑RARα融合基因中的Brc3亚型，其特征在于：所述ddPCR方法包括提取血液中的RNA及QC评估，具体操作过程如下：（1）提取RNA，将血浆分装在1.5ml EP管中，每管分装300μl；使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μl CL至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；（2）加入150μl buffer PKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；13400rpm离心15min，转移上清160μl至1.5ml EP管中；将上清置于恒温仪上80℃ 孵育15min，13400rpm快速离心30s；加入320μl buffer RLT，吹打混匀，再加入1000μl 96～100%乙醇，涡旋混匀；（3）每次转移700μl样本至RNeasy MinElute离心柱中，13400rpm离心15s，弃滤液，重复本步骤直到将所有样本过柱完毕；加350μl buffer FRN到离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液；（4）配mix:10μl DNaseI和70μl buffer RDD，吹打混匀，将其加到离心柱中的膜上，置于室温20～30℃温度下15min；加500μl buffer FRN至离心柱，13400 rpm离心15s，保留滤液；换一个新的2ml收集管，将滤液重新加入到离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液；（5）加入500μl buffer RPE至离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液，重复一次；将离心柱置于新的2ml收集管中，管盖打开，13400rpm离心5min；将离心柱置于新的1.5ml EP管中，加入25μl RNase‑free water至离心柱中央的滤膜上，闭合管盖，室温15～25℃温度下静置1min；13400rpm 离心1min；提取的RNA立即进行反转录或冻存于‑80℃；（6）RNA QC评估：使用Nanodrop对RNA进行定量并参考A260/280数据，或者使用labchip /2100进行RNA质量评估，评估RIN值。