[发明专利]一种设计和构建猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的方法在审
| 申请号： | 201710533398.9 | 申请日： | 2017-07-03 |
| 公开（公告）号： | CN109207515A | 公开（公告）日： | 2019-01-15 |
| 发明（设计）人： | 谢胜松;赵书红;赵长志;李新云;刘向东;韩晓松;杨高娟;高杨;陈毅龙;杜小勇;苗义良;马云龙;刘小磊;梅书棋 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/113;C12N15/90;C40B40/02;C40B50/06 |
| 代理公司： | 上海一平知识产权代理有限公司 31266 | 代理人： | 王正君;马思敏 |
| 地址： | 430070 湖北省武*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种设计和构建猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的方法。具体地，本发明首次开发一种针对猪全基因组水平蛋白编码基因、lincRNA和miRNA设计特异性sgRNA，并由此构建CRISPR/Cas9的慢病毒敲除文库的方法，可利用该策略实现高通量筛选猪的功能基因。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 敲除 文库 全基因组 蛋白编码基因 全基因组水平 高通量筛选 功能基因 慢病毒 开发 | ||
【主权项】：
1.一种猪全基因组特异性sgRNA文库，其特征在于，所述文库包括：(i)N种表达猪特异性sgRNA的载体，其中N为≥20000的正整数，所述的猪特异性sgRNA是针对猪全基因组的靶基因，并且所述的靶基因选自下组：(a)蛋白编码基因、(b)lincRNA基因、(c)miRNA基因、(d)上述(a)、(b)和(c)的组合；并且，所述的猪特异性sgRNA具有以下结构特征：(1)sgRNA所针对的靶基因位点中含有的PAM为NGG，其中N为A、T、C、G任意碱基；(2)sgRNA长度为19或20nt；(3)sgRNA的GC含量选择40‑60％；(4)sgRNA的全基因组脱靶评估选择不含1和2个碱基错配脱靶位点，且相比较其它sgRNA，选择脱靶数量相对较少的sgRNA；(5)对于靶向蛋白编码基因的猪特异性sgRNA，其结合位置位于所述编码基因的起始密码子ATG下游500bp区域内；对于靶向lincRNA基因的猪特异性sgRNA，其结合位置位于所述lincRNA转录起始点下游的500bp区域内；对于靶向miRNA基因的猪特异性sgRNA，其结合位置为miRNA前体序列或成熟序列；以及(ii)任选的M种阴性对照载体，所述的阴性对照载体为表达无关sgRNA的载体，其中M为正整数。
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