[发明专利]一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法

摘要

本发明公开了一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，包括如下步骤(1)准备待测目标蛋白质的抗体；(2)将获得的抗体用生物素进行标记；(3)合成三段单链寡聚核苷酸；(4)分别将两段寡聚核苷酸的5’端和3’端用亲和素进行标记；(5)设计Taqman探针和对应的引物；(6)利用生物素‑亲和素之间的放大亲和反应，用寡聚核苷酸标记抗体。(6)将待测目标蛋白用缓冲溶液稀释至5000分子/μL以下的浓度，并在其中加入寡聚核酸标记的两种抗体、第三条寡聚核酸片段及DNA连接酶，形成抗原‑抗体复合物。然后进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为浓度c0；(7)再次进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为c1；(8)待测目标蛋白的浓度为c0‑c1。

主权项

一种基于数字PCR的蛋白质活性浓度测定基准方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)准备待测目标蛋白质的抗体，如果是多克隆抗体，准备一种即可；如果是单克隆抗体，需要准备针对不同表位的两种单克隆抗体；(2)将获得的抗体用生物素进行标记；(3)合成三段单链寡聚核苷酸，其中两段寡聚核苷酸连接后可与第三段形成具有100～200bp的互补序列，可形成双链DNA；(4)分别将两段寡聚核苷酸的5’端和3’端用亲和素进行标记；(5)针对寡聚核苷酸形成的双链片段，设计Taqman探针和对应的引物；(6)利用生物素‑亲和素之间的放大亲和反应，用寡聚核苷酸标记抗体；如果采用的是多克隆抗体，将多克隆抗体分成两个部分，每个部分分别与一种寡聚核苷酸混合，形成两种寡聚核苷酸标记的多克隆抗体；如果是单克隆抗体，每种单克隆抗体分别与一种寡聚核苷酸混合，形成两种寡聚核苷酸标记的单克隆抗体；(7)将待测目标蛋白用缓冲溶液稀释至5000分子/μL以下的浓度，在其中加入寡聚核酸标记的两种抗体、第三条寡聚核酸片段及DNA连接酶，形成抗原‑抗体复合物；然后在其中加入扩增缓冲液、4种dNTP混合物、抗原‑抗体复合物、Taqman探针及引物、Taq DNA聚合酶、Mg2+，进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为浓度c0；(8)在(7)的条件下，除了目标蛋白溶液用双蒸水替代，其它条件与(7)的条件一致，再次进行数字PCR扩增反应，得到的拷贝数记为c1；(9)待测目标蛋白的浓度为c0‑c1，单位为分子数/μL；如果需要，将分子数浓度除以阿伏伽德罗常数后即得到摩尔浓度。