[发明专利]用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法

摘要

本发明公开了一种用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法，包括下列步骤：（1）菌株的鉴定和培养基；（2）同位素标记和冷激过程；（3）样品制备。本发明利用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌，同位素内标与其他非标记或化学方法相比，最大的好处就是：最大限度的降低了因试剂、操作、纯度等等一系列在实验中无法避免的负面影响所造成的误差，尤其是在蛋白质操作过程中，由于是直接将N15和N14混合成一个样品来分析，成为一个整体的体系，最大限度的减小了双体系分析所造成的误差。

主权项

用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)菌株的鉴定和培养基分离得到的副溶血性弧菌，经鉴定，可信度达到95％以上；(2)同位素标记和冷激过程菌株纯培养物经生理盐水稀释后，划线接种胰蛋白胨酵母抽提物大豆琼脂平板(TSA‑YE，Difco)，37℃培养24小时；然后取两个菌落，分别接种14N和15N培养基，接种14N的培养基在4℃条件下培养2周作为实验测试菌株；另一个菌落接种在15N培养基中37℃培养12小时，然后在同样条件下再转接一到两次；15N标记的菌作为实验质控菌株，然后将标记好的菌放在‑80℃超低温环境，等待2周后与14N同时进行蛋白质组分析；(3)样品制备首先对分别用15N和14N培养的菌株培养物分别进行OD定量，定量值是OD600＝0.4；取15N和14N菌株培养物各0.3mL，加入50mmol/L Tris/HCl(pH＝7.4)，然后12000转5分钟离心，弃上清后置于冰上，然后在4℃下，用间歇超声震荡2分钟，然后12000转离心20分钟，弃上清得蛋白质组；然后取15N和14N蛋白质组各5μg，按一比一混合，得总量10μg蛋白质组样品，用5mM的碘乙酰胺进行烷基化处理，然后用蛋白酶进行酶切，经反向高效液相色谱进行分离后‑20℃保存；反向高效液相色谱(RP‑HPLC)条件如下：流动相A：0.1％(v/v)的甲酸水溶液，即甲酸和水的比例是0.1％；流动相B：0.1％(v/v)的甲酸乙腈溶液，即甲酸和乙腈的比例是0.1％；溶剂梯度：时间(min)持续时间(min)％B00315:0015816:001851:00351866:00152867:0019575:00895流速：400nL/min质谱条件：此次质谱选用Orbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)；scan range:375‑1,300Da Top‑50；MSl resolution:60,000Positive mode；Collision energy:35CID。