[发明专利]一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法

摘要

本发明提供了一种人促卵泡激素同源竞争酶联免疫分析方法来检测与量化促卵泡激素药物或相关促卵泡激素样品的体外生物学活性。本发明是一种利用抗原‑‑抗体免疫亲和性来检测、量化和反映人促卵泡激素体外生物学活性的分析方法。本发明与临床上化学发光免疫分析法检测人促卵泡激素的效果相比，其易于操作，生产成本较低，能同时检测多个样品浓度，并在一定范围内根据酶标仪检测的吸光值可直接反映出测试的人促卵泡激素的体外生物学活性。本发明所检测的曲线范围宽广，且标品或样品稀释梯度符合线性规律(直接采用倍比稀释)。此外检测灵敏度虽然以IU/ml为单位，实质性达到了以mIU/ml为单位计算促卵泡激素体外生物学活性。

主权项

一种检测与量化人促卵泡激素体外生物学活性的同源竞争酶联免疫分析法，其特征在于：包括以下步骤：(1)抗原包被：96孔酶标板中包被60ul/well尿源促卵泡激素(丽申宝)溶液(1IU/ml or 1000IU/L)，放置4℃冰箱过夜；同时在同一酶标板中用磷酸盐缓冲液PBS(PH7.2‑7.4)分别包被5孔作非特异性结合组和4孔作空白对照组；(2)封闭：第二天，用PBS包含0.05％Tween‑20(PBST)清洗酶标板3次，每次60‑90秒，随后可以采用以下4种任意一种封闭方式进行封闭：a)5％的脱脂奶粉(320ul/well)封闭,37℃避光孵育2.5h；b)PBST包含3％的胎牛血清(FBS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；c)PBST包含2％的牛血清蛋白(BSA)封闭(320ul/well)，37℃避光孵育1h；d)PBS包含2.5％的正常羊血清(NGS)(320ul/well)封闭，37℃避光孵育1h；(3)孵育一抗：在分配到封闭好的酶标板前，50ul尿源促卵泡激素标品(丽申宝)、50ul重组促卵泡激素(果纳芬)和50ul其他促卵泡激素供试样品分别预先与50ul的单克隆anti–FSHα抗体稀释液(最终稀释浓度为1：24000)在1.5ml离心管中，放置4℃冰箱孵育过夜；尿源促卵泡激素(丽申宝)既是作包被抗原也作促卵泡激素标品，标准曲线检测范围设置在0.015‑1.98IU/ml。随后分别将100ul anti–FSHα抗体与尿源促卵泡激素混合液、100ul anti–FSHα抗体与重组促卵泡激素混合液、100ul anti–FSHα抗体与其他促卵泡激素样品混合液加入到用PBST清洗3次的封闭好的酶标板中，放置4℃冰箱无震荡孵育48h；最大吸光值(B0)和非特异性结合(NBS)只接受100ul单克隆anti–FSHα抗体最终稀释溶液(1:24000)，空白对照组直接添加PBS溶液；(4)孵育酶标二抗：用PBST清洗酶标板5次，每次60‑90秒，清洗完后每孔添加100ul羊抗鼠‑HRP抗体稀释液(用PBS稀释，1:3000)，37℃避光孵育40min；(5)颜色反应:用PBST清洗酶标板5次，每次60‑90秒，清洗完后每孔添加100ul TMB显色液，37℃避光孵育8‑10min，随后添加2M 50ul/well的硫酸终止反应，使用酶标仪(Thermo Labsystem MK‑3)在450nm读取吸光值；(6)原始数据处理:将原始数据导入Excel软件初步处理，随后利用GraphPad Prism 5软件进一步处理，以标品和供试样品的浓度为横坐标，对应的450nm下吸光比值(Bi/Bo)为纵坐标，绘制标准曲线和供试样品的剂量‑反应曲线，同时利用Origin pro 8软件进行拟合线性回归分析。