[发明专利]一种利用多倍体花药培养创建二倍体水稻品系的方法

摘要

本发明提出了一种利用多倍体花药培养创建二倍体水稻品系的方法，它是充分利用经过减数分裂后细胞内染色体减半的特点，通过花药培养使已通过减数分裂形成的小孢子在其合适的发育阶段，经过诱导培养后形成愈伤组织，并经分化出苗而形成稳定的二倍体水稻品系，与其对应的四倍体水稻品系构建成2x，4x材料体系，它包括：a.选择稳定的四倍体水稻品系作培养基材；b.取材观察花药发育时期为处于小孢子单核靠边期的幼穗；c.低温预处理幼穗；d.花药愈伤组织诱导；e.花药愈伤组织分化出苗；f.芽苗分化出根；g.形态学和细胞学技术确定花药培养形成植株的二倍体真实性。本发明方法简单，成本低，容易操作。

主权项

1.一种利用多倍体花药培养创建二倍体水稻品系的方法，其特征在于培育过程为：a.选择稳定的四倍体水稻品系作培养基材采用PMeS品系杂交后结实率>70％、形态特征稳定的四倍体水稻品系作培养基材；b.取材观察花药发育，确定是否正处于小孢子单核靠边期在四倍体水稻的孕穗期，取剑叶叶枕与下一页叶枕距‑0.5～+0.5cm的幼穗，取2个颖花，从中挑出花药，用0.3％—0.5％I‑KI溶液制片观察,确定该花药正处于小孢子单核靠边期；c.低温预处理幼穗将正处于小孢子单核靠边期的四倍体水稻幼穗，去除下层叶片，保留后三片的叶鞘，用浸过滤水的两层纱布包裹后装入封口的塑料袋内，置于冰箱0℃‑4℃条件下预处理3天‑7天；d.花药愈伤组织诱导剥取预处理的幼穗，经一般消毒处理后，挑取颖花中的花药或将合适的颖花从紧靠花药基部剪短颖花，再将其在瓶口处敲打使花药落入花药愈伤组织诱导培养基中；置于黑暗条件，25℃～28℃下培养25天～30天后，逐渐可见花药中生长出愈伤组织，随后长大；所述愈伤组织诱导培养基配方为N₆+2,4‑D 0.5mg/L‑1.5mg/L+NAA 0.5mg/L‑1.O mg/L+KT0.5mg/L‑1.0mg/L+水解乳蛋白50mg/L‑100mg/L+天冬酰胺10mg/L～15mg/L+谷酰胺10mg/L～15mg/L+蔗糖3％～5％+琼脂0.75％；e.花药愈伤组织分化出苗当花药愈伤组织生长35天～50天后，呈现出淡黄色、较紧实大颗粒状时，将其挑选入愈伤组织分化培养基，置于光照2000lx～3000lx条件下培养，愈伤组织逐渐显现出绿色点块，直至分化出芽苗；所述愈伤组织分化培养基为MS+KT1.5mg/L～2.5mg/L+NAA 0.5mg/L～0.75mg/L+水解乳蛋白50mg/L～100mg/L+天冬酰胺10mg/L～15mg/L+谷酰胺10mg/L～15mg/L+3％蔗糖+琼脂0.75％；f.芽苗分化出根当花药愈伤组织分化芽苗长至0.3cm～1.5cm高度时，将其分块转入生根培养基中，培养10天～30天分化出根而成完整植株；所述生根培养基为1/2～2/3MS常用培养基+NAA 0.5mg/L‑0.75mg/L+KT 0.1mg/l‑0.5mg/L+活性炭0.05％+蔗糖1.5％+琼脂0.75％；g.用细胞学技术确定花药培养形成植株的二倍体真实性将栽培的植株根尖，经染色体制片观察，二倍体为2n＝2x＝24；四倍体为2n＝4x＝48；快速检查，或者采用倍性快速测试仪检查倍性，用以正式确定花药培养形成植株的二倍体真实性。