[发明专利]一种利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法

摘要

本发明提出了一种利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法，其步骤为a.选择四倍体常规水稻品系或光温敏雄性不育系作为材料；b.确定该花药是否处于小孢子单核发育早中期；c.未受精子房愈伤组织诱导的漂浮培养；d.子房愈伤组织分化出苗；e.芽苗分化出根；f.确定未受精子房培养植株的二倍体真实性。是一种“利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法”。本发明解决了目前多倍体水稻品系都来源于多次杂交、长期选择后形成，没有直接对应的二倍体品系以及四倍体水稻光温敏不育系在长日照高温期雄性不育而难以进行花药培养的实际问题。

主权项

1.一种利用四倍体未受精子房培养创建二倍体水稻品系的方法，其特征在于培育过程为：a.选择稳定的四倍体常规水稻品系或光温敏雄性不育系作为材料；b.观察确定该花药是否处于小孢子单核发育早中期在四倍体水稻的孕穗期，取剑叶叶枕与下一叶叶枕距‑1.0cm～+2.5cm的幼穗，取3个颖花，从中挑出花药，用0.3％—0.5％I‑KI溶液制片观察，确定该花药处于小孢子单核发育早中期，此特征是正对应胚囊发育的成熟期；c.未受精子房愈伤组织诱导的漂浮培养经消毒处理后的合适幼穗，用尖镊子小心剥去颖壳而保留花药和子房于一体的小花，接种在液体愈伤组织诱导培养基上，让其漂浮在液面，减少振动防止下沉，置于黑暗条件25℃～28℃下培养，28天～40天后逐渐可见子房膨大像不均匀小球，靠近花柄端常有内生愈伤组织出现，此时同培养的花药愈伤组织也生长并逐渐长大；所述诱导培养基配方为N₆+MCPA(2甲基4氯基苯氧乙酸)0.05mg/l～0.15mg/l+NAA 0.1mg/L～0.5mg/L+KT 0.1mg/L～0.5mg/L+水解乳蛋白50mg/L～100mg/L+蔗糖3.5％～6.0％；d.子房愈伤组织分化出苗无菌挑出上一步骤培养的膨大子房，挑出其内淡乳黄色愈伤组织，置于愈伤组织分化培养基上，在光照2000Lx～3000Lx条件下培养，愈伤组织逐渐显现绿色，并分化出芽苗；所述分化培养基为MS+KT1.0mg/L～3.0mg/L+NAA 0.3mg/L～0.70mg/L+水解乳蛋白50mg/L～100mg/L+天冬酰胺10mg/L～20mg/L+谷酰胺10mg/L～20mg/L+蔗糖3％+琼脂0.75％；e.芽苗分化出根当长至0.5cm～2.0cm高度时，将这些子房愈伤组织分化出的芽苗，分块接种到生根培养基中，培养15天～30天分化出根而成为完整植株；所述培养基为1/2～2/3MS培养基+NAA 0.3mg/L～0.70mg/L+KT 0.1mg/l～0.55mg/L+活性炭0.03％～0.05％+蔗糖1.5％～2.0％+琼脂0.75％；f.确定未受精子房培养植株的二倍体真实性形态学上观察幼苗叶片下表皮的气孔及其保卫细胞的叶绿体数，二倍体比四倍体少近一倍；用细胞学的染色体制片观察培养后获得植株根尖细胞的染色体，二倍体为2n＝2x＝24，四倍体为2n＝4x＝48，这样确定子房培养植株中的二倍体真实性。