[发明专利]一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法

摘要

本发明提供一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵工程领域，具体方法是将构建重组后保存在液氮中的基因工程种子，经过活化，摇瓶培养，扩大转至发酵罐中通气搅拌培养，当菌体OD600生长至5之间加入诱导剂，然后在发酵罐中根据菌种生长曲线、营养需求和PH变化调整补料和搅拌速度，通气量等，待菌体停止生长进入衰亡期时下罐，经过粗纯提取和浓缩复性得到粗酶体。本发明通过优化溶氧量、发酵培养基、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需要的营养条件及外部环境，大大提高了下罐时的菌体含量及产物产量，使菌体含量由现有的25g/L提高到了45g/L。

主权项

一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子菌活化：将液氮中保存的工作种子菌于37°水浴解冻，然后KaNa/菌以1∶1000比例接种于15ml离心管中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度为30°，培养时间为8‑9h；(2)种子菌培养：将活化好的菌种扩大转接至500ml三角摇瓶中，继续使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度为30°，培养时间为16‑17h；(3)发酵：将培养好的种子液按1∶1000接入发酵罐进行发酵，发酵培养基是3L，通气量为9L/min，设定培养温度为37°，机械搅拌转速为400rpm/min，控制PH为6.8‑7.2；(4)诱导：在步骤(3)发酵2.5‑4小时之间，紫外分光光度计测定OD600，在4‑6之间，以1∶500加入IPTG 10ml；(5)补料：上罐时补料200ml，诱导后一小时补料500ml，诱导后5小时补料400ml，诱导后21小时补料200ml；(6)消泡剂：不定时查看罐内状态，有泡沫产生加入几滴消泡剂，诱导后5小时加入100ml；(7)生长状态：自诱导后每隔一小时取样测定OD600，培养24～27小时，待0D值开始下降便下罐；(8)湿菌收集：8500rpm/min，4°离心15min，弃上清流沉淀，称出湿菌重量，正常大概45g/L左右；(9)破碎菌体：湿菌中加入破碎液，体积为菌重总数的六倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；(10)湿菌中加入洗液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；(11)湿菌中加入溶液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声清洗机洗涤，工作20min，静置隔夜，然后8500rpm/min离心30min，弃沉淀留上清；(12)超滤复性浓缩：将最后一次离心留下的上清液使用0.22um孔径的膜包进行超滤复性收集未通过膜包的上游液体并加入上清液五倍的复性液，待复性液复完，浓缩为1.5L，即为基因工程菌的粗制品。