[发明专利]一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法

摘要

本发明属于食品致病菌检测技术领域，具体公开了一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括收集待测样品，环糊精处理样品，制备膨润土包被活性炭，制备膨润土包被活性炭处理样品，PCR检测等步骤。本发明的方法整个操作步骤简单，可以有效的将致病菌从食品中分离，无需前增菌，对样品的检测时间为4小时，时间短且检测限仅为10cfu/25g，检测灵敏度高，不容易出现假阴性结果。

主权项

一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，收集待测样品S2，制备环糊精处理样品向待测牡蛎样品中加无菌生理盐水，均质处理，加入环糊精，并使溶液中环糊精最终浓度为10g/100ml，均质处理，低速离心去除大颗粒物质，所得上清液高速离心，将沉淀物溶于0.01M醋酸生理盐水缓冲液，得到环糊精处理样品；S3，制备膨润土包被活性炭活性炭用去离子清洗，沥干备用；向膨润土中加入去离子水，膨润土与去离子水的比例为1g：50ml，震荡1min，700rpm离心1min，弃沉淀，将上层溶液转至干净的容器中，加入沥干的活性炭，上层溶液与沥干的活性炭之间的比为例为4ml：1g，37℃摇床过夜，随后55℃烘干，得到膨润土包被活性炭；S4，制备膨润土包被活性炭处理样品用0.85％生理盐水清洗膨润土包被活性炭，将环糊精处理样品与清洗好的膨润土包被活性炭混合，室温震荡；将震荡后的混合物转移至装有玻璃棉的容器内，用醋酸生理盐水缓冲液清洗并收集洗脱液；洗脱液离心，弃去上清液；将沉淀悬浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精DNA溶液和去离子水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的DNA，加入无菌去离子水溶解沉淀的DNA，得到DNA模板，备用；S5，PCR检测PCR检测使用的引物序列为：inlB1：5’‑AATCACTTTCTTTGGAGCATAATGGTATAAGTG‑3’inlB2：5’‑GTTCCATCAACATCATAACTTACTGTGTAAACC‑3’如果获得的PCR检测产物片段为279bp，则结果为阳性。