[发明专利]一种共发酵葡萄糖和木糖生产L-乳酸的乳酸片球菌构建方法

摘要

本发明公开了一种共发酵葡萄糖和木糖生产L‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，属于基因工程技术领域。构建步骤包括，利用热敏型敲除系统在L‑乳酸生产菌株乳酸片球菌Pediococcusacidilactici TY112(保藏号为CGMCC NO.8664)基因组上整合异源木糖异构酶，木酮糖激酶，转酮醇酶以及转醛醇酶编码基因；敲除磷酸转酮酶和乙酸激酶编码基因；适应性进化提高共发酵葡萄糖和木糖的能力。本发明成功得到了一株高效共发酵葡萄糖和木糖生产光学纯L‑乳酸的工程菌株，并命名为P.acidilactici ZY271，其保藏号为CGMCC NO.13611。

主权项

1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产L‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，步骤包括：(1)木糖代谢在P.acidilactici TY112中的实现：将携带木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB)的表达质粒pMG36e‑PldhD_xylAB_2911电转化至P.acidilactici TY112，得到的重组菌P.acidilactici TY112(pMG36e‑PldhD_xylAB_2911)可利用木糖进行生长和L‑乳酸生产，但同时产生了大量副产物乙酸。(2)磷酸转酮酶路径(PK路径)的阻断：通过同源重组敲除P.acidilactici TY112基因组上的磷酸转酮酶基因pkt，以阻断PK路径从而减少副产物乙酸生成，得到的工程菌株为P.acidilactici TY112‑Δpkt。(3)戊糖磷酸路径(PP路径)的构建：在步骤(2)得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶基因(tkt)和转醛醇酶基因(tal)整合至步骤(2)中敲除的pkt基因位点处，使菌株通过PP路径代谢木糖，得到的工程菌株为P.acidilactici TY112‑Δpkt::(tkt_tal)。(4)xylAB的整合以及乙酸激酶ackA2的插入失活：在步骤(3)得到的菌株基础上，将步骤(1)中的xylAB表达框整合至乙酸激酶ackA2位点处，同时将ackA2进行插入失活，得到的工程菌株为P.acidilactici TY112‑Δpkt::(tkt_tal)‑ΔackA2::xylAB。(5)适应性进化加快木糖代谢：将步骤(4)得到的工程菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性进化以提高木糖代谢能力。