[发明专利]一种检测血清中抗EV‑D68病毒抗体的方法

摘要

本发明公开了一种检测血清中抗EV‑D68病毒抗体的方法。提取EV‑D68病毒基因组RNA，通过反转录和PCR扩增反应得到VP1基因的cDNA，将其克隆到克隆载体，再将转入表达载体得到重组表达质粒，转化宿主菌并用IPTG诱导蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、复性、纯化得到可以作为鉴别诊断抗原的VP1融合蛋白。将抗原包被96孔酶标板，用间接Elisa方法检测已用EV‑D68灭活病毒抗原及佐剂制备的EV‑D68灭活疫苗免疫后的新西兰大白兔、恒河猴、小鼠的血清，来确定大肠杆菌表达的VP1融合蛋白作为检测抗原的敏感性和特异性。本发明确定了与EV‑D68VP1蛋白相结合的抗体的亲和力，具有操作简单，特异性高、灵敏度高、耗时短、成本低的特点。

主权项

一种检测血清中抗EV‑D68病毒抗体的方法，包括以下步骤：(1)EV‑D68病毒VP1蛋白基因的克隆和重组表达载体pGEX‑5X‑VP1的构建：①使用商品化的总RNA提取试剂盒，从感染EV‑D68病毒的Vero细胞中提取病毒总RNA；将病毒总RNA反转录为cDNA；②PCR扩增：以cDNA为模板，用上游引物5'‑gct caa acc act tac atg‑3'，斜体划线处为上游酶切位点EcoR I，和下游引物5'‑gcc tcaggt ggt tac tat gtt gtg‑3'，斜体划线处为下游酶切位点Xho I，进行PCR扩增后使用商品化DNA片段胶回收试剂盒进行片段回收；③目的片段与pGEX‑5X‑1载体的酶切回收：胶回收纯化后的VP1片段和pGEX‑5X‑1分别用EcoR I和Xho I双酶切，用商品化胶回收试剂盒纯化目的片段和载体片段，电泳观察回收情况；④目的片段VP1与表达载体连接：连接反应总体系为20μl，具体连接反应体系按照试剂盒说明书要求配制；⑤DH5α感受态细胞的转化：以10‑20μl连接反应物在100μl DH5α感受态细胞中进行转化后，涂布于预热至37℃的LB琼脂平板上，37℃培养16‑18h；⑥pGEX‑5X‑VP1质粒鉴定：在超净工作台里用灭菌枪头从平板上挑取单个白色菌落，接种于3‑5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃温度下，摇床速度为200‑220 rpm/min，振荡培养16‑18h；使用商品化质粒提取试剂盒提取质粒pGEX‑5X‑VP1并进行测序确证；(2)融合蛋白VP1的表达和纯化：①将含有质粒pGEX‑5X‑VP1的阳性克隆转化到感受态细胞中，并涂布到LB固体平板上，37℃培养过夜，挑取单个克隆培养扩增后进行蛋白表达；以1:100比例接种到30ml‑100ml LB液体培养基中，37℃培养2.5‑3小时，A600值达到0.6‑0.8，加入终浓度为0.5‑1mmol/L IPTG，诱导表达4‑6小时后进行SDS‑PAGE分析及Western‑blot分析；②SDS‑PAGE电泳检测：将收集的菌液12000rpm/min离心1min，用80μl PBS重悬，加入20μl 5×上样缓冲液，混匀，75‑100℃，煮5min，用上样针进样20μl，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到100V，继续电泳达到胶的底部；取下整块凝胶用考马斯亮蓝染液染色/脱色；③Western‑blot印迹分析：取出SDS‑PAGE凝胶，按照滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序叠放转膜10‑30min；取出PVDF膜，放入玻璃平皿中，经过封闭，一抗孵育，二抗孵育后，进行ECL化学发光显色并观察结果；④VP1融合蛋白大量诱导表达：条件和小量的相同，将体积扩大到1L LB的液体培养基；诱导结束后，8000‑12000rpm/min离心30min，收集菌体，使用0.01mmol/L PBS，pH＝8.0缓冲液洗涤两次后重悬，冰浴中超声破碎；收集菌体沉淀；⑤包涵体溶解和复性：按照包涵体溶解液(ml):大肠杆菌菌体湿重(g)＝10:1的比例混匀，45℃水浴2h，期间每隔30min，轻轻搅拌一次，8000rpm/min，离心15min，取上清液加入透析袋中，并将透析袋置于包涵体复性液中，4℃透析复性48h；⑥包涵体纯化：包涵体复性后，通过亲和层析纯化蛋白，用Western‑blot检测纯化后的重组蛋白；⑦纯化后蛋白浓度测定：按照Bradford法蛋白定量试剂盒步骤进行；根据标准曲线计算样品中VP1融合蛋白的蛋白浓度；(3)VP1融合蛋白与不同种属特异性抗体结合能力的Elisa检测：①抗原包被：以纯化的VP1融合蛋白包被高亲和力的酶标板，包被液为PBS，pH＝7.4，每孔蛋白含量为0.5μg，4℃过夜，设3个复孔；②一抗稀释：以EV‑D68灭活病毒免疫的不同种属的动物血清作为一抗，以2倍梯度稀释法稀释成以下不同的梯度：1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240；在酶标板中加入稀释好的不同浓度梯度的一抗，室温孵育2h；③洗涤后加入不同种属动物对应的带有HRP标记的二抗，二抗稀释比例为1:5000，每孔加入100μl，室温1h；④显色：洗涤后在酶标板中加入单组份TMB显色液，100μl/孔，轻轻震荡混匀，37℃5分钟，按照50μl/孔加入2mol/L的硫酸终止反应；⑤测定：以空白孔调零，450nm波长依次测定各孔的吸光度值即OD值，OD阳性血清/OD阴性血清大于2.1时判断为阳性；以OD阳性血清/OD阴性血清值大于2.1时的最大血清稀释度即为血清效价。