[发明专利]一种马铃薯酪氨酸酶提取及最佳反应时间确立方法

摘要

本发明公开了一种马铃薯酪氨酸酶提取及最佳反应时间确立方法，本发明针对传统酶提取出现的问题如杂质多，易褐化，酶也容易受温度的影响，采用低温避光处理+交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)+硫酸铵钝化保护蛋白，将提取的马铃薯酪氨酸酶溶液保存，所得的酶液OD475值≧0.8，活性较高，并能够较长时间的保存，更利于试验操作的进行。同时，根据紫外扫描，另外，根据酪氨酸酶与底物反应的速率，确定了反应达到最佳效果的时间。

主权项

一种马铃薯酪氨酸酶提取及最佳反应时间确立方法，其特征在于：包括试剂与仪器：马铃薯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、硫酸铵、L‑左旋多巴、高速组织匀浆机、真空抽滤机、低温冷冻离心机、真空冷冻干燥机、UV‑260紫外分光光度计；0.05mol/L磷酸缓冲液的配制：先各自配制0.2mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4250ml，按照1:1的比例配制得到0.1mol/L的PBS缓冲液，并用0.1mol/L的调节PH在6.8；酶提取方法包括以下步骤：(1)称取洗净的马铃薯，去皮切成小丁500g，于冰箱里预冷10小时，加入20g经过滤的交联聚乙烯吡咯烷，按照土豆比例加入0.1mol/L的缓冲液，用高速组织捣碎机匀浆，再用纱布抽滤，此过程应保证迅速，防止马铃薯酪氨酸酶氧化；(2)将所得的粗酶液置于烧杯中，并加保鲜膜密封，整个过程均置于冰盒中，用温度计测得酶液的实际温度查寻硫酸铵的饱和度表，0℃每100ml加入16.4(NH4)2SO4至30％饱和度，加入过程中不停地搅拌；(3)依次分装到50ml离心管中，在恒温冰盒静置沉淀30min，在4℃、8000r/min离心15min；(4)取出离心管于冰盒中，保证温度取上清溶液继续加入(NH4)2SO4，100ml加入43.6g，达到70％饱和度，4℃，8000r/min离心20min，取出离心管去上清，下层沉淀用缓冲液溶解；(5)放置于冰箱速冻，再于真空冷冻干燥机中干燥，粗酶干燥粉末；(6)酶粉呈浅棕色，质地疏松，置于‑20℃冰箱保存，需要时再取粉末酶于缓冲液中溶解，在475nm波长下测得OD值大于1，而经文献报道一般OD475≧0.8即可用；L‑Dopa的配制：取0.075g的L‑Dopa，用PH6.8的磷酸盐缓冲液，定容至100ml，现配现用，装入棕色的试剂瓶中；于石英比色皿中加入酶液，在紫外分光光度计下扫全波。