[发明专利]基于CILLC-MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法

摘要

本发明涉及胎盘来源间充质干细胞代谢物的萃取及检测技术，旨在提供一种基于CILLC‑MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法。本发明通过萃取、检测GFP基因转染前后的hPMSCs的胞内代谢物，并对其进行定量，深入分析转染前后的差异性代谢物及差异性代谢途径，从代谢组学角度评估绿色荧光蛋白用于标记和示踪间充质干细胞的生物安全性。本发明首创比较hPMSCs与GFP+hPMSCs代谢组学差异的分析流程，将两种样品制备方法结合用于干细胞代谢物萃取，使细胞内代谢物充分释放。结合CIL LC‑MS用于干细胞胞内代谢物检测，实现了胞内代谢物的精准定量分析，并大大增加代谢产物的鉴定种类。本发明极大地提高了结果的灵敏性，可靠性和重复性，避免了操作上引起的不平行性及偶然性。

主权项

1.基于CILLC‑MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人胎盘来源间充质干细胞的分离培养与转染人胎盘来源间充质干细胞的分离培养：无菌条件下取临床废弃的新鲜胎盘组织，用PBS充分洗涤去血渍后，剪弃胎盘组织表面的膜；将剩下的胎盘组织剪碎，以0.2％四型胶原酶消化，37℃消化1h，过滤，用磷酸盐缓冲液冲洗，收集消化液和冲洗液；洗涤细胞沉淀后，用MSCs专用培养基重悬，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱进行常规培养；GFP转染人胎盘来源间充质干细胞：当常规培养的人胎盘来源间充质干细胞的融汇率达50％时，加入重组慢病毒悬液进行转染；转染后继续培养24h，然后用新的培养基换掉旧培养基继续培养3‑4d，再加入10μg/mL的嘌呤霉素进行筛选：未转染成功的人胎盘来源间充质干细胞死亡，成功转染GFP的人胎盘来源间充质干细胞存活，从而得到表达GFP的胎盘MSCs；(2)代谢物的提取将表达GFP的胎盘MSCs传代至3‑5代后，去旧培养基并清洗细胞表面，淬灭；分别以9/1体积比的甲醇/三氯甲烷溶剂和1/1体积比的甲醇/水溶剂萃取，刮下细胞，行超声辅助破碎，离心取上清的代谢物，浓缩干燥仪冻干后备用；(3)同位素标记取出冻干后的代谢物，加水溶解后，加乙腈和碳酸钠/碳酸氢钠；然后用¹²C‑丹磺酰氯标记轻链，用¹³C‑‑丹磺酰氯标记重链，水浴行标记反应；加氢氧化钠和甲酸中和反应，离心后进行定量；(4)液相色谱‑紫外光谱定量基于液相色谱‑紫外光谱联用技术进行梯度洗脱，设定样品管理器的温度、进样方式、柱温、优化流动相的组成、溶剂的比例和洗脱梯度的陡度，使各个色谱峰之间达到最佳的分离；(5)液相色谱‑质谱联用方法鉴定实验所用的人胎盘来源间充质干细胞与GFP标记后人胎盘来源间充质干细胞各6份，将最后得到的样品每个等分，其中一部分标记¹²C‑丹磺酰氯，另一部分标记¹³C‑丹磺酰氯；根据液相色谱‑紫外光谱定量结果，将同一种萃取方法，不同类型细胞的¹²C‑丹酰氯化物标记的轻链与¹³C‑丹酰氯化物标记的重链1:1混合上机；检测样本之前，空白、检测样本、质控样本连续进样，考察LC‑MS的重复性和稳定性；每检测4个目的样品检测一次空白、检测样本、质控样本，以此交替进行；(6)数据处理用R‑based in‑house软件对检测分析得到的原始数据进行预处理，得到包含保留时间、质荷比和峰强度的三维矩阵表；将三维矩阵表导入到SIMCA‑P15.0软件进行多元数据分析，通过主成分分析、偏最小二乘判别、火山图来进行代谢数据分析；基于丹酰氯化物标记标注数据库和人类代谢组学数据库、代谢物数据库鉴定代谢物，基于MetaboAnalyst数据库及KEGG数据库分析差异性代谢途径。