[发明专利]荧光定量PCR法检测端粒酶催化亚基mRNA的试剂盒

摘要

本发明涉及一种实时荧光定量PCR检测端粒酶催化亚基hTERT mRNA的试剂盒，该试剂盒通过逆转录（RT）mRNA样品得到cDNA,再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以定量检测标本hTERT 的mRNA表达量。本发明所提供的试剂盒可以用于临床及科研中检测患者的外周血中hTERT的表达，为胃癌的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

主权项

1. hTERT mRNA荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，特征为：包含红细胞裂解液、总RNA抽提试剂、无RNA酶的水、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；除标准品用TE溶解外，其他各种溶液所用溶剂均为纯化水；（1）红细胞裂解液的配制方法为在1000ml水中加入8.29克氯化铵，1.00克碳酸氢钾，37.2毫克 Na2EDTA, pH值为7.2‑7.4；（2）总RNA抽提试剂的主要成分为苯酚、异硫氰酸胍和β‑巯基乙醇；（3）无RNA酶的水制备方法为：向去离子水加入焦炭酸二乙酯，至体积终浓度为0.05%，22‑25℃放置10‑12小时后，121℃，20min高压，22‑25℃放置备用；（4）反转录缓冲液包含9.1umol/L Oligo(dT)12‑18、3.6U/ul RNA酶抑制剂、182mmol/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、273mmol/L氯化钾、11mmol/L氯化镁、纯化水；其中182mmol/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3；（5）逆转录酶储存液包含20mmol/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、100mmol/L氯化钠、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫苏糖醇、体积比为50%的甘油、体积比为0.01%的Nonidet p‑40、200U/ul逆转录酶、纯化水；其中20mmol/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；（6）dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐‑纯化水溶液，pH 7.0‑7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L；（7）PCR反应液包含18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液、2.78mmol/L氯化镁、92.6mmol/L氯化钾、0.37mmol/L上下游引物、0.1U/ul Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、400nmol/L dTTP、水；其中18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷‑盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3；上下游引物序列分别为：P1： 5'‑AGTGTCTGGAGCAAGTTGCAAA‑3'；P2： 5'‑GCAGCTGCACCCTCTTCAA‑3'；（8）探针为荧光标记探针，其序列为：5'‑FAM‑CATTGGAATCAGACAGCA‑TAMRA‑3'探针的浓度为: 2umol/L,,TE溶液溶解,TE溶液的组成为10mmol/L 三羟甲基氨基甲烷‑盐酸, lmmo1/L乙二胺四乙酸,水;（9）标准品的序列为:GTCACGGAGACCACGTTTCAAAAGAACAGGCTCTTTTTCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTGCAAAGCATTGGAATCAGACAGCACTTGAAGAGGGTGCAGCTGCGGGAGCTGTCGGAAGCAGAGGTCAGGCAGCATCGGGAAGCCAGGCCCGCCCTGCTGACGTCCAGACTCCGC标准品浓度为: 2×106copies/ul, TE溶液溶解, TE 溶液的组成为10mmol/L 三羟甲基氨基甲烷一盐酸,,lmmol/L 乙二胺四乙酸,纯化水;（10）对照品分为阳性对照品与阴性对照品,阳性对照品为含有hTERT cDNA的样品,浓度为103copies/µ1, TE溶解,阴性对照品为外周血总RNA的反转录产物。