[发明专利]一种hAECs‑DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法

摘要

本发明公开了一种hAECs‑DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法，包括以下步骤1)构建hAECs‑DED组织工程皮肤结构以人羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞，以人去表皮的真皮组织(De‑epidermized dermis,DED)作为支架材料，将种子细胞种植于支架材料上构建hAECs‑DED组织工程皮肤；2)组织工程皮肤组织学观察；3)免疫组化染色；4)透射电镜观察组织工程皮肤超微结构，并拍片。本发明通过免疫组化的方法检测了器官培养的人工皮肤的基底膜成分，用透射电镜观察可见在新生表皮的基底细胞与DED间可见半桥粒结构，本发明的检测方法对重建的组织工程皮肤表皮完整的性，角质层丰富性、以及其结构和功能与人体正常皮肤的差异等进行了研究，为重建的组织工程皮肤的应用奠定了基础。

主权项

一种hAECs‑DED组织工程皮肤增殖分化活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建hAECs‑DED组织工程皮肤结构：以人羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞，以人去表皮的真皮组织(De‑epidermized dermis,DED)作为支架材料，将种子细胞种植于支架材料上构建hAECs‑DED组织工程皮肤；2)组织工程皮肤组织学观察：将体外培养的hAECs‑DED组织工程皮肤气‑液面培养2周后进行肉眼观察，主要观察表面是否光滑，是否有膜状物形成；再进行常规石蜡切片(约4um)，苏木精‑伊红染色(HE染色)，在光镜下观察组织学特征，观察新生表皮结构是否清晰，层次是否分明，角质层角化是否完全，细胞排列是否整齐；3)免疫组化染色：包括广谱细胞角蛋白免疫组化染色(CKpan染色)、波形蛋白免疫组化染色(vimentin染色)、Ki67免疫组化染色、角蛋白19(CK19)免疫组化染色、角蛋白18(CK18)免疫组化染色、角蛋白14(CK14)免疫组化染色、角蛋白10(CK10)免疫组化染色、丝聚合蛋白(Filaggrin)免疫组化染色、过碘酸雪夫氏染色(PAS)、Ⅳ型胶原染色、层粘蛋白染色(laminin染色)、桥粒芯蛋白免疫组化染色(desmoglein)；4)透射电镜观察组织工程皮肤超微结构，并拍片；主要观察细胞质内线粒体(mitochondria，Mt)和角蛋白细丝(keratin filaments,KF)结构、以及相邻的细胞膜上的细胞桥粒(desmosomes，D)结构、新生表皮与DED之间是否可见基底膜结构，以及基底膜带的近表皮侧是否可见半桥粒(Hemidesmosomes，HD)结构。