[发明专利]一种同时检测甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法

摘要

一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法，属于生物化学分析检测领域。本发明通过在血浆/尿液中加入同位素内标溶液，混合均匀后过经活化平衡的96孔板，再经过淋洗、洗脱，最后收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。采用离线SPE法进行样本预处理，较在线SPE法节省成本，既能有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应。本发明首次应用国产C18CEX SPE填料，建立了一种同时定量测定血浆/尿液中MN和NMN的超高效液相色谱串联质谱法。该预处理方法操作简单、且国产填料的应用打破市场垄断，超高效液相色谱串联质谱法灵敏度高、专属性强、定量准确，具有良好的临床应用前景。

主权项

一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品的制备取待测样品至EP管中，加入同位素内标溶液后，96孔板经活化，平衡后上样，再经过3次淋洗，最后洗脱，收集含甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的洗脱液；所述同位素内标溶液为含有d3‑变肾上腺素、d3‑去甲变肾上腺素，3次的淋洗液依次为：纯水、甲醇、乙腈，洗脱液为：乙腈（2）标准曲线的制备以甲氧基肾上腺素的浓度为横坐标，以甲氧基肾上腺素与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为标准曲线；甲氧基肾上腺素的标准曲线为Y=0.728X﹣0.052；以甲氧基去甲肾上腺素的浓度为横坐标，以甲氧基去甲肾上腺素与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为标准曲线；甲氧基去甲肾上腺素的标准曲线为Y=0.488X+0.001；（3）利用HPLC‑MS/MS对上述洗脱液进行分析和采集取300 μL待测样品于EP管中，加入20μL内标液，混匀待用，96孔板用500 μL甲醇活化，500 μL纯水平衡，上样300 μL，依次用纯水，甲醇，乙腈淋洗，最后用200 μL乙腈洗脱，得到含有甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的洗脱液，吸取150 μL上述洗脱液进行串联质谱分析；液相色谱条件为，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC@BEH HILIC 2.1×100mm，1.7μm；柱温：40℃，进样室温度：4℃，流速：0.4mL/min，进样体积：10 μL，流动相A: 0.2%甲酸水溶液，流动相B: 乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；质谱条件为：离子源：ESI+；脱溶剂气流速：800 mL/h；脱溶剂温度：500℃；毛细管电压：3KV；表1梯度洗脱程序Time（min）流动相A（v%）流动相B（v%）0.05951.030702.030703.040605.0595甲氧基肾上腺素和NMN与内标的峰面积比，分别带入甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的标准曲线，得到甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的浓度。