[发明专利]一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法。本发明将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌中大量表达完成，加入细胞裂解液，离心去除细胞碎片，在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，充分孵育后，离心分离，在离心后的微球介质中采用淋洗液进行梯度淋洗，淋洗后用加入咪唑的上述缓冲溶液充分洗脱，收集洗脱液。本方法实现了采用金属螯合亲和色谱梯度洗脱纯化硫氧还蛋白的效果，具有目标蛋白吸附量大、产品纯度高、洗脱条件温和、成本低、操作简便高效等特点，适合规模化应用。

主权项

一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将硫氧还蛋白重组质粒(其基因序列如SEQ ID NO.1所示)置于大肠杆菌的细胞中，得菌液；在LB细胞培养液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸，溶剂为水)中培养细胞(菌液与细胞培养液体积比为1：100)，使重组质粒表达完成，之后细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗若干次，加入细胞裂解液，细胞裂解液的加入量与细胞培养液的体积比为1：1～1：20，摇动至溶液成透明状，6000～16000r/min下离心5～60min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，固定金属离子的物质的量与细胞培养液的体积的比例为1：1～1：20(mol：mL)，孵育5～80min后，离心分离。(2)在离心后余下的微球介质中采用淋洗液(含有NaCl的缓冲溶液)进行梯度淋洗，采用的梯度淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用含有20～400mM咪唑的缓冲溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，得到金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白。