[发明专利]一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法

摘要

一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，属于生物检测领域。本发明包括磁纳米粒子修饰赭曲霉毒素A适配体，磁纳米粒子修饰的适配体与部分互补DNA分子形成部分杂交的DNA双链结构，DNA修饰的金纳米粒子探针的制备，赭曲霉毒素A比色传感器的构建。本发明借助于赭曲霉毒素A适配体对赭曲霉毒素A分子特异性识别功能，在不同浓度赭曲霉毒素A存在的条件下，通过连接酶链式反应使得金纳米粒子的组装程度不同，从而形成不同的颜色梯度，通过测定反应后紫外吸收值的变化从而实现对目标赭曲霉毒素A的检测。本发明方法检测灵敏度高、检测限低、特异性好、检测结果易于观察，为痕量赭曲霉毒素A的检测提供了一种有效的方法。

主权项

一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，其特征在于包括如下具体步骤：（1）磁纳米粒子修饰赭曲霉毒素A适配体将新合成的粒径为200‑400nm浓度为1mg mL‑1的羧基修饰的磁纳米粒子，用pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液稀释10倍，再向1mL稀释好的磁纳米粒子中加入0.068mg碳二亚胺和0.15mg N‑羟基硫代琥珀酰亚胺，将其放到摇床上在室温条件下振荡活化20min，然后将50μL浓度为10μM的3’端氨基修饰的赭曲霉毒素A适配体DNA片段加入以上活化好的磁纳米粒子中，室温条件下振荡反应3h后，用磁力架吸附磁纳米粒子使其在离心管底部聚集，同时去除上清液以除去未偶联的游离适配体DNA分子，然后加入1mL 0.01M的pH8.0的TE缓冲液将磁纳米粒子进行重悬；赭曲霉毒素A适配体：5’‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAAAA‑NH2‑3’；（2）磁纳米粒子修饰的适配体与部分互补DNA分子形成部分杂交DNA双链结构将与赭曲霉毒素A适配体部分互补的DNA片段加入步骤（1）中修饰好的磁纳米粒子中使其终浓度为1μM，然后将其放入37℃恒温水浴锅中孵育2h以使互补的DNA片段充分杂交，再用磁力架对磁纳米粒子进行洗脱，以除去游离的DNA分子，再用pH7.0的结合缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，从而得到磁纳米粒子修饰的部分杂交DNA双链结构；与赭曲霉毒素A适配体部分互补DNA：5’‑CCACACCCGATCGGTAACCGACCG‑3’；（3）DNA修饰的金纳米粒子探针的制备将4mL新合成的15‑25nm的金纳米粒子在9000r/min的条件下离心将其浓缩10倍，并用pH7.4 0.01M的PBS缓冲液将其重悬，测得其终浓度为25nM，然后将浓缩好的金纳米粒子分装成每管200μL 的两管，将巯基修饰的两种DNA探针分子分别加入到浓缩好的金纳米粒子中，使其DNA探针分子的终浓度均为100nM，在室温条件下过夜孵育后，将其在10000r/min条件下离心，以除去未结合的DNA探针分子，然后用pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将其重悬，得到DNA修饰的金纳米粒子探针；巯基修饰的两种DNA探针分子能够与步骤（2）中与赭曲霉毒素A适配体部分互补的DNA的两端能够完全互补的DNA分子；探针1：5’ ‑GATCGGGTGTGGAAAAA‑SH‑3’，探针2：5’‑SH‑AAAAACGGTCGGTTACC‑3’；（4）赭曲霉毒素A比色传感器的构建将步骤（2）中制备的磁纳米粒子修饰的部分杂交DNA双链结构分装到PCR管中每管100μL ，然后将起始浓度为100000 pg mL‑1赭曲霉毒素A标准品溶液10倍梯度稀释8个浓度，将其分别加入到PCR管中每管10μL，然后在45℃条件下孵育20‑50min；将孵育后的反应体系用磁力架进行分离，并分别收集含有解离下DNA的上清液；每种上清液分别取10μL分别加入不同PCR管中，然后在每个PCR管中分别加入步骤（3）中制备的两种DNA修饰的金纳米粒子探针各5μL、5μL 50U的DNA连接酶、10μL 5×PCR 缓冲液、以及另外两种DNA分子探针各5μL，使得总的反应体系为45μL，将其放入PCR扩增仪上进行连接酶链式反应，反应条件为：首先在90℃预变性30s，然后60℃反应2min、90℃变性30s，总共为30个循环，其中另外两种DNA分子探针为模板DNA分子独立的两端；反应后分别测定金纳米粒子在630nm和521nm的紫外吸收值，并得到A630/A521的紫外吸收比值，建立赭曲霉毒素A浓度与A630/A521两者之间的标准曲线，从而实现对赭曲霉毒素A的定量检测；探针3：5’‑CCACACCCGATC‑3’，探针4：5’‑GGTAACCGACCG‑3’。