[发明专利]一种葡萄根尖染色体常规压片的方法

摘要

本发明公开了一种葡萄根尖染色体常规压片的方法，包括材料培养、预处理、固定、保存、解离、染色、压片和镜检。本发明培养的葡萄枝条生根，方法简便，且根尖粗细适中，易于制作染色体压片，得到的压片标本细胞平整、染色体分散；使用饱和对二氯苯溶液预处理可提高压片成功率，使染色体缩短变粗，降低细胞质粘度，获得了更多的染色体中期分裂相；采用3.5%混合酶液酶解，使细胞壁分解，分生区组织细胞间的果胶质分解，使细胞分散好，染色体分散空间更大，染色体分散均匀，便于计数。本发明制备方法简便、快捷，制作成本低，易于操作，得到的细胞分裂相好，准确度高，对于了解葡萄遗传背景、育种过程中父母本的选择及后期鉴定具有重要意义。

主权项

一种葡萄根尖染色体常规压片的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）材料培养 冬剪时选取生长健壮的一年生枝条，冬季沙藏三个月后，取出枝条，将枝条剪截成长度为10~15 cm插条，每根插条留2~3芽，剪截插条时上剪口距离上芽1.5~2 cm、平剪，下剪口在靠近截部、斜剪，将插条完全浸入清水中浸泡24 h，达到剪口截面呈鲜绿色，捞出沥干，然后基部向下浸入100 mg /L 的萘乙酸溶液中24 h，插条放入锥形瓶中培养，水深2~4 cm，置于光照培养箱中，光强2000 Lx，光照12 h，恒温24℃培养，一周换水一次，培养15~25 d后，用剪刀剪下根尖2～3 cm，放入锥形瓶；（2）预处理 将（1）得到的根尖浸入饱和对二氯苯溶液中，封口，常温下暗处理2~4 h；（3）固定将预处理后的根尖用蒸馏水冲洗三次，置于现配的卡诺固定液中，封口，4 ℃条件下固定24~48 h；（4）保存 固定后的根尖如不立即进行压片，可将材料常温下过酒精梯度，95%酒精10~30 min，80%酒精10~30 min，最后于70%酒精中4 ℃低温保存；（5）解离 将固定后根尖取出，蒸馏水清洗三次，置于2 mL离心管中，再往离心管中加入3.5%混合酶液，混合酶液和根尖的体积比为30∶1，37 ℃恒温酶解20~30 min，然后用蒸馏水冲洗2~3次，置于蒸馏水中备用；（5）染色 将解离后的根尖置于载玻片上，用吸水纸吸干根尖周围的水分，用镊子将取下的根尖夹碎，滴入一滴卡宝品红染色液，染色2~3 min；（6）压片 染色后的根尖上盖上盖玻片，吸水纸盖上盖玻片，用带有橡皮擦的铅笔一端敲打盖玻片，制成压片；（7）镜检 把制好的片子置于显微镜下镜检，先在100倍下找到细胞群，再在1000倍下观察拍照，最后根据图片对染色体进行计数。