[发明专利]一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法及应用

摘要

本发明公开了一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法，并成功构建了Mdr1a/1b基因敲除大鼠模型，为研究P‑糖蛋白(P‑glycoprotein,P‑gp)的功能例如介导药物的转运提供了新的动物模型。本发明首次利用CRISPR/Cas9技术进行大鼠P‑gp的基因敲除，通过Mdr1a和Mdr1b靶点设计、sgRNA体外合成与转录、假孕鼠的准备、受精卵体外显微注射与胚胎移植等过程得到了F0代嵌合鼠，再经过两代繁殖筛选，最终得到了Mdr1a/1b双基因敲除的纯合子大鼠。经T7EI核酸内切酶验证，在所得到的基因敲除大鼠中没有出现脱靶现象。

主权项

1.一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)Mdr1a与Mdr1b靶点的选择；利用在线靶点预测网站选择Mdr1a与Mdr1b敲除靶点；(2)sgRNA的合成与提取；首先合成一段长度为60bp的Oligo片段，其中包括敲除靶点和T7启动子的序列；然后，以Oligo片段为模板，通过重叠PCR反应合成完整的sgRNA双链模板，长度为130bp，并经酚氯仿提取的方法将sgRNA双链模板提取分离；最后，用T7体外转录试剂盒将sgRNA双链模板进行体外转录，将转录产物提取分离，得到Mdr1a和Mdr1b基因的sgRNA；(3)sgRNA和Cas9mRNA共注射与胚胎移植；将两种sgRNA与Cas9mRNA显微共注射入大鼠受精卵胞浆中；其中，所述sgRNA为Mdr1a和Mdr1b基因的sgRNA；(4)F0代基因型鉴定；提取F0代大鼠基因组DNA，并设计引物分别扩增Mdr1a和Mdr1b基因靶点附近序列，连接载体进行测序，鉴定基因突变情况；(5)F0代繁育与F1代基因型鉴定；将同时携带Mdr1a/1b可用突变的F0代与野生型合笼，将F1代基因组提取后PCR扩增Mdr1a和Mdr1b基因靶点附近序列，进行测序；(6)F1代繁育与F2代基因型鉴定；将携带Mdr1a/1b可用突变的F1代雌雄个体进行交配，得到F2代，将F2代基因组提取后PCR扩增Mdr1a和Mdr1b基因靶点附近序列，得到Mdr1a/1b基因敲除的个体；(7)脱靶效应检测；根据脱靶效应预测网站，找到针对Mdr1a或Mdr1b的sgRNA所引起脱靶可能性较大的位点，设计引物验证这些位点是否发生突变。