[发明专利]一种分离和培养甘草茎尖生长点干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种分离和培养甘草茎尖生长点干细胞的方法，包括取材、离体培养、悬浮培养、看护培养、单细胞克隆培养及继代培养步骤，本发明可以有效地分离和培养甘草茎尖生长点干细胞，也可以用于其它药用植物茎尖生长点干细胞的分离和培养，本发明的甘草干细胞是从甘草幼苗的茎尖生长点上制备得来，其具有生长速度快，抗逆能力强，能够进行无限分裂的特点，且因为其具有更小体积的液泡，所以耐剪切力更强，使甘草干细胞可以进行超大体积的液体悬浮培养，减少生产成本。

主权项

1.一种分离和培养甘草茎尖生长点干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、取材：取甘草种子在超净工作台上用1%的次氯酸灭菌5分钟，再用无菌水清洗3遍，然后接种在有MS固体培养基的培养皿上，在22℃条件下萌发；在体式显微镜下将萌发1周后的幼苗的茎尖生长点切割成细胞团块，该细胞团块含有生长点干细胞和周围临近的体细胞；步骤二、离体培养：将上述切割下来的茎尖生长点放置在含有萘乙酸1.0mg/L与激动素0.2mg/L的MS固体培养基上培养，2周后可以得到直径为8mm的细胞团；步骤三、悬浮培养：将细胞团转移到含有1.0 mg/L的萘乙酸与0.5 mg/L的激动素的MS液体培养基，在22℃条件下经过两周振荡培养后可以得到一个分散的同时含有干细胞和体细胞的悬浮细胞系，悬浮细胞系经过过滤后可得到由干细胞和体细胞混合的细胞群；步骤四、看护培养：将这些由干细胞和体细胞混合的细胞群转移到看护培养基上进行看护培养，看护培养基是由添加1.0 mg/L 萘乙酸与0.5 mg/L的激动素的MS固体培养基，在该培养基上先铺一层由甘草幼茎诱导而来的愈伤细胞，在这层愈伤细胞上再铺一层滤纸，然后将过滤的由干细胞和体细胞混合的细胞群铺在该层滤纸上，在温度22℃和黑暗的条件下培养1个月，可以观察到滤纸上有多个单细胞克隆长出；步骤五、单细胞克隆培养：将单细胞克隆挑出并转移到含有1.0 mg/L 萘乙酸与0.5 mg/L 激动素的MS固体培养基上进一步培养，待生长到较大的细胞团块时，取部分细胞团块用中性红染色后进行镜检，在干细胞内部有很多密集且体积小的被染色的液泡；步骤六、继代培养：将得到的干细胞进一步在含有0.2 mg/L 6‑苄氨基嘌呤、2.0 mg/L萘乙酸与1.0 mg/L激动素的MS培养基上进一步培养，培养条件为26~28℃，每日光照12h，光照强度为1500~2000Lx，可以在短时间内获得大量的甘草干细胞。