[发明专利]基于dPCR的新型全自动荧光信号采集分析方法

摘要

本发明属于图像处理领域，特别是一种基于dPCR(digital Polymerase Chain Reaction数字聚合酶链式反应)的新型全自动荧光信号采集分析方法。该方法利用图像区域划分——图像拼接——信号采集与分析的思想来提取并分析荧光信号。该方法首次以工程化的方式将荧光信号采集分析方法应用于dPCR后期的结果检测，通过合理的设计使整个系统实现了全自动化，避免了人工干涉例如手动标记、逐行扫描等等所产生的测量误差，准确性好，操作控制方便，有效提高了系统的检测精度和检测效率，通过拼接步骤可以将所采集的零散图像完美拼接成设计时的原图像大小，高度还原原图，方便后期对荧光信号的分析与检测，提高了检测的精确度。

主权项

一种基于dPCR的新型全自动荧光信号采集分析方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：制作dPCR芯片，dPCR芯片为我们利用微纳米加工技术制作出的带有特殊标记的高密度微孔型dPCR芯片，其整体尺寸为N*N㎜，区域A为微反应腔的部分，边缘尺寸为M*M㎜，在dPCR芯片边缘和微反应腔A边缘构成的环形区域内有六个特殊的十字标记中P1，P2，P3，P4，P5，P6，规定dPCR芯片上与P1最接近的顶点为坐标原点，P1、P2中心点连线并指向P2的方向为x正方向，P1、P5中心点连线并指向P5的方向为y正方向，若设P1的中心坐标为P1(a,b)(0<a,b<(N‑M)/2)，则其他五点的中心坐标分别为P2(N‑a,b)，P3(a，N/2)，P4(N‑a，N/2)，P5(a，N‑b)，P6(N‑a，N‑b)；该六个十字标记的中心所构成的矩形区域的大小为(N‑2a)*(N‑2a)；步骤2：创建十字标记识别数据库；对步骤1中的dPCR芯片拍摄，得到倍率大小、清晰度、十字标记完整度不完全相同的阳性图片和阴性图片，其中，阳性图片是指含有十字标记的图片，阴性图片是指不含有十字标记的图片；通过设定所有阳性图片的ROIs；，创建十字标记的识别数据库；步骤3：初始化，设定各方向和各顶点，采集图像；该步骤由以下子步骤完成：子步骤1：以P1、P2的中心点连线的方向作为水平方向，以P1、P5的中心点连线的方向作为竖直方向；将图像信息转换成矩阵，根据CCD照相机下一张图片的像素大小e*f与相应的dPCR芯片微反应腔的尺寸d，找到像素与单位微米之间的换算关系；利用CCD照相机下一张图片的像素大小e*f、dPCR芯片的尺寸N*N以及像素和微米之间的换算关系计算得到划分采集区域的总数目sNr(1)*sNr(2)(分别代表在水平方向和竖直方向所需采集照片的数目)和可编程微动控制平台的步进量stepSize(1)和stepSize(2)(分别代表在水平方向和竖直方向上的步进量)；由e‑stepSize(1)和f‑stepSize(2)得到相邻两张图片之间的重叠距离overlap(1)和overlap(2)，overlap(1)和overlap(2)分别代表在水平方向和竖直方向上相邻两张图片的重叠距离，判断overlap(1)>e/4～e/3并且overlap(2)>f/4～f/3是否成立，如果成立，进行子步骤2，如果不成立，增大sNr并按照子步骤1所述方法重新计算stepSize和overlap，直至满足条件为止，进行子步骤2；子步骤2：从芯片的四个顶点中任选一个作为初始顶点，与该初始顶点最相近的一个十字标记记为Pz，z的取值为1,2,5,6，将含有初始顶点、Pz和部分微反应腔等三部分的图片作为第一张拍摄图片，该图片的位置即当前位置，当前位置坐标由初始顶点坐标来表示；子步骤3：初始化当前位置为初始位置，初始位置坐标由当前位置坐标表示，从初始位置开始遍历当前dPCR芯片的所有区域，遵循先水平方向后竖直方向的原则逐行扫描，扫描过程中，根据初始位置坐标及可编程微动控制平台的步进量确定第j步移动后的理论位置坐标(Xj0,Yj0)，同时可编程微动控制平台根据上述计算的步进量stepSize完成第j步移动，移动后的位置坐标记为(Xj0’,Yj0’)，判断(Xj0,Yj0)与(Xj0’,Yj0’)是否相同，若相同，进行拍照等候下一步移动；若不同，可编程微动控制平台连续五次尝试移动到(Xj0,Yj0)位置，在五次移动过程中，每次移动后的位置坐标记为(Xji,Yji)(i＝1,2,3,4,5),第i次移动完成后，判断(Xji,Yji)与(Xj0,Yj0)是否相同，并得到实际位置(Xji,Yji)与理论位置(Xj0,Yj0)的偏差er，若(Xji,Yji)与(Xj0,Yj0)相同，则进行拍照并进行第j+1步移动，若五次移动完成后(Xji,Yji)与(Xj0,Yj0)仍不同，则根据偏差er自动调整至理论位置(Xj0,Yj0)，再进行拍照并进行第j+1步移动；子步骤4：扫描全部完成，得到图片O11、O12、……、OsNr(2)sNr(1)，进行步骤4；步骤4：在水平方向和竖直方向拼接图片，每个方向上两张待拼接图片的位置分别有两种情况，，由以下子步骤来完成：子步骤1：取第t(t＝1,2,……,sNr(2))行的前两张图片Ot1、Oti(i＝2,3,……，sNr(1))，设置具有1/30～1/50*overlap个像素点宽度的比较块，在图片Ot1、Oti之间进行相关性比较，将k行q列比较区域内的相关性记为R1、R2、……、Rn，找到最大的相关性Rmax＝max{R1、R2、……、Rn}和重叠位置第k’行第q’列，则取Ot1的(k’+1：f’)行，(1，q’)列，取Oti的(1：f‑k’)行，(1，e)列，拼接成一张新的图片并删除原来的图片Ot1，将新的图片作为第t行第一张图片，记为Ot1，再将Ot1与下一张图片Oti按照上述步骤进行拼接，依次类推，直至该行所有sNr(1)张图片全部拼接完成；得到每行拼接完成的最新图片O11，O21，……，Ot1，然后转子步骤2；子步骤2：记O11，O21，……，Ot1分别为O1，O2，……，Ot，取O1、Oj(j＝2，3，……，t)两张图片，设置具有1/30～1/50*overlap个像素点宽度的比较块，在图片O1、Oj之间进行相关性比较，将kk行qq列比较区域内的相关性记为R11、R22、……、Rnn，找到最大的相关性Rmmax＝max{R11、R22、……、Rnn}和重叠位置第k”行第q”列，则取O1的(1：k”)行，(1，q”)列，取Oj的(1：f2)行，(q”+1，e2)列，拼接成一张新的图片并删除原来的图片O1，将新的图片作为当前第一张图片，重新记为O1，再将O1与下一张图片Oj按照子步骤2进行拼接，直至所有sNr(2)张图片全部拼接完成，得到最新的完整图片O1，其大小记为N’*M’；步骤5：将图片O1划分为六个区域，分别记为M1，M2，M3，M4，M5，M6，每个区域的大小均为N’/2*M’/3，该六个区域内各含有一个十字标记；取Mi(i＝1，2,3,4,5,6)，根据步骤2创建的十字标记识别数据库识别Mi中的十字标记，并利用canny算子寻找十字标记的边缘，通过霍夫转换检测并画出相关直线，从而得到Mi中十字标记的四条边缘直线，记为li1，li2，li3，li4；最后根据解析几何的算法计算出四条直线的四个交叉点，记为vi1，vi2，vi3，vi4，从而得到六个标记的中心坐标，记为c1(Xc1，Yc1)，c2(Xc2，Yc2)，c3(Xc3，Yc3)，c4(Xc4，Yc4)，c5(Xc5，Yc5)，c6(Xc6，Yc6)；步骤6：由tan‑1((Ycj‑Yci)/(Xcj‑Xci))(j＝2,4,6；i＝1,3,5)计算水平方向上c1和c2、c3和c4、c5和c6的相对偏转角度并记为α1、α2、α3，由tan‑1((Xcj‑Xci)/(Ycj‑Yci))(j＝3,4,5，6；i＝1,2，3，4)计算竖直方向上c1和c3、c1和c5、c3和c5、c2和c4、c2和c6、c4和c6的相对偏转角度并记为α4、α5、α6、α7、α8、α9，分别取其平均值，即αx＝(α1+α2+α3)/3，αy＝(α4+α5+α6+α7+α8+α9)/6，αx和αy即为图片O1在水平方向和竖直方向上的偏转角度，取α＝(αx+αy)/2，则α即为O1的偏转角度，根据Yc1‑Yc2与零的关系确定O1的偏转方向，从而将O1按顺时针(或逆时针)方向旋转角度α，得到新的图片，重新记为O1，其大小记为N”*M”；步骤7：重复步骤5，得到新图片O1上六个标记的中心坐标，重新记为c1(Xc1，Yc1)，c2(Xc2，Yc2)，c3(Xc3，Yc3)，c4(Xc4，Yc4)，c5(Xc5，Yc5)，c6(Xc6，Yc6)，并转至步骤8；步骤8：裁剪掉O1上由ci(i＝1,2，……，6)所构成的矩形区域G以外的部分，并将G以内的部分放大或缩小，得到新的图片记为OO，使OO的尺寸与步骤1中所述dPCR芯片同一部分的尺寸相同，为(N‑2a)*(N‑2a)；步骤9：以dPCR芯片上十字标记P1的中心坐标作为基点坐标，记为(0,0)，第i(i＝1,2，……，n‑1，n，n为微反应腔的总数目)个微反应腔的圆心为中心坐标，作直径为d的圆，记为圆CEi，圆CEi的位置即为图片OO上第i个微反应腔的位置，将圆CEi内(包括边缘)所有点的值设置为i，其余值均设置为0，建立(N‑2a)*(N‑2a)的矩阵B，设矩阵B中数据i的位置为b1行b2列，则提取图片OO中b1行b2列的数据fy，取fy的平均值并记为Fi，Fi即为dPCR芯片上第i个微反应腔的荧光强度，统计相同Fi的个数并记为Numi,从而得到实验结果，实验结果由荧光强度Fi及其个数Numi表示。