[发明专利]阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法

摘要

本发明涉及阳离子脂质体非病毒基因载体领域，具体涉及阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法。本发明通过琼脂糖凝胶电泳技术定性定量的分析阳离子脂质体与基因的解离过程；通过在复合物中加入荧光染料，建立荧光共振能量转移体系，采用荧光光谱技术及停流光谱技术检测阳离子脂质体与基因在细胞外及细胞内的解离过程，拟合其解离动力学曲线符合非线性方程。本发明公开的阳离子脂质体/基因复合物解离动力学的检测方法，适用于研究带正电荷的阳离子脂质体/基因复合物细胞外及细胞内解离动力学过程，拓宽了琼脂糖凝胶电泳技术、荧光光谱技术和停流光谱技术的应用，并为阳离子脂质体介导基因递送机制研究及进一步应用研究提供理论基础。

主权项

阳离子脂质体/基因复合物解离动力学检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)阳离子脂质体与基因按照质量比6：1～1：1制备阳离子脂质体/基因复合物，加入浓度为0.02‑2μg/μL竞争性结合剂与基因竞争性结合阳离子脂质体，使基因从复合物中释放，采用琼脂糖凝胶电泳检测阳离子脂质体/基因复合物解离0～48h基因从复合物中的释放情况，采用凝胶成像系统软件定量分析阳离子脂质体解离基因的量；(2)根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加入荧光染料与阳离子脂质体竞争性结合基因，建立荧光共振能量转移体系，使基因从复合物中解离，荧光染料与基因的质量比1:1～24:1，解离0～48h，采用荧光光谱测量基因从复合物释放不同时间后的发光强度；采用停流光谱仪检测0‑200s内基因从复合物中瞬时释放动力学，得到解离动力学曲线，通过停流光谱仪分析软件进行线性拟合，得到结合动力学轨迹符合线性方程；y＝0.1027ln(x)+0.9015；(3)利用透射电子显微镜检测阳离子脂质体/基因复合物的细胞内解离过程：培养肿瘤细胞种植于6孔细胞培养板中，使其在转染日细胞密度达80～90％；根据步骤(1)制备阳离子脂质体/基因复合物，加到细胞培养板中，培育0h～96h，将肿瘤细胞制成细胞悬液，加入戊二醛固定24h，经树脂包埋后进行细胞超薄切片，再经醋酸双氧铀染色后，在透射电镜下观察基因在肿瘤细胞内的释放情况，透射电镜加速电压为100kV。