[发明专利]一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒

摘要

本提供一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，肠道病毒的四个亚型为EV71、CVAl6、CVA6、CVA10。本发明运用一步法实时荧光定量RT‐PCR技术，采用EV及EV71、CVAl6、CVA6、CVA10病毒高度特异的引物和荧光标记探针，通过一个PCR反应即从粪便标本中同时检测出肠道病毒的存在，并同时进行病毒分型鉴定，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。本发明对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床早期诊断提供工具，为临床治疗方案的制定提供参考依据。可应用于肠道病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断、肠道病毒快速筛查分型、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。

主权项

1.一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒，由荧光PCR检测混合液、酶混合液、肠道病毒阳性对照品、阴性对照品、肠道病毒定量标准品1‑5号组成，其特征在于，其中荧光PCR检测混合液内含有PCR反应缓冲液和引物探针混合液，引物探针混合液含EV、EV71、CVAl6、CVA6、CVA10五组引物和相应的五种不同荧光标记的探针，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，阴性对照品为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，肠道病毒阳性对照品为内含肠道病毒5’端非转录编码区RNA序列的病毒样颗粒，肠道病毒定量标准品1‑5号为浓度：103 copies/ml‑1×107copies/ml的内含肠道病毒5’端非转录编码区DNA序列的阳性质粒样品；引物探针混合液中五组上游引物和下游引物以及相应的五种不同荧光标记的探针序列如下：上游引物EV ‑F: 5’‑ CCCTGAATGCGGCTAATCC‑3’，下游引物EV‑R: 5’‑ ATTGTCACCATAAGCAGCCA‑3’，特异性探针EV‑P: 5’‑ROX‑ AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC‑BHQ2‑3’，上游引物EV71‑F: 5’‑ GAGYATGATYGARACACGCTG‑3’，下游引物EV71‑R: 5’‑ CGCTCTRCTRAAGAARCTATC‑3’，特异性探针EV71‑P: 5’‑ FAM ‑ AACTCGCACAGTACRGCTGARACCAC ‑BHQ1‑3’，上游引物CVA16‑F: 5’‑ CCCAATGGYGAGYTAGTCCCC‑3’，下游引物CVA16‑R: 5’‑ GTTGGTRGCWGTYTGCCAAGC‑3’，特异性探针CVA16‑P: 5’‑VIC‑ AGTAYATGTATGTCCCRCCAGGGGCT‑BHQ1‑3’，上游引物CVA6‑F: 5’‑ AARCCRGATAGYAGGAAATC ‑3’，下游引物CVA6‑R: 5’‑ GGGGTGGATCACTCAATTTTG ‑3’，特异性探针CVA6‑P: 5’‑CY5‑ CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG –BHQ3‑3’，上游引物CVA10‑F: 5’‑ GAGACTGGACGYGTRCCA‑3’，下游引物CVA10‑R: 5’‑GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG‑3’，特异性探针CVA10‑P: 5’‑TAMRA‑CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC‑BHQ2‑3’；其中EV、EV71、CVA16、CVA6、CVA10的特异性探针序列5’端分别采用ROX、FAM、VIC、CY5、TAMARA 5种不同荧光基团标记，3’端分别采用与荧光基团对应的BHQ1、BHQ2或BHQ3淬灭基团标记。