[发明专利]RT-qPCR检测猕猴SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法

摘要

本发明提供一种RT‑qPCR检测猕猴SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，以猕猴新鲜肾脏组织提取的总RNA反转录成cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，获得SLC2A9/GLUT9基因片段和内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；通过常规处理得到均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值，为研究猕猴葡萄糖转运子9功能以及相关药物对其影响提供了有效途径。本发明适用于实时定量PCR检测，其操作简单，可重复性高，检测成本低、灵敏性高、特异性强。

主权项

1.一种RT‑qPCR检测猕猴SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：猕猴SLC2A9/GLUT9基因表达水平的特异性上、下游引物为：SLC2A9/GLUT9 F：5’‑ CCACGCTACCTGCTCTTGGA ‑3’SLC2A9/GLUT9 R：5’‑ TGCTTTACCCAAGAACGTTTGGA ‑3’作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：GAPDH F：5＇‑AGCCCCATCACCATCTTCC‑3＇GAPDH R：5＇‑ AATGAGCCCCAGCCTTCTC ‑3＇；（2）以猕猴新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得猕猴肾脏组织cDNA第一链；（3）以步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9 F和SLC2A9/GLUT9 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC2A9/GLUT9基因片段和内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；所述PCR扩增体系及反应条件如下：PCR扩增体系即25μL体系：SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；（4）将步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10‑1、10‑2、10‑3、10‑4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9 F和SLC2A9/GLUT9 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC2A9/GLUT9基因和内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的猕猴肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFX Manager 软件处理，得出均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值。