[发明专利]蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗及其在免疫层析纸的应用

摘要

本发明公开蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗及其在免疫层析纸的应用，针对现有技术中蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测方法耗时较长，操作技术要求较高，不利于现场快速检测的问题，通过PLMP基因扩增、原核表达载体pGEX‑4T‑1‑PLMP的构建、PLMP重组蛋白的诱导表达及纯化、PLMP多克隆抗体的制备等步骤制备PLMP多抗，构建的PLMP重组蛋白效率高，分离纯化方法简单，周期短并将其应用在胶体金免疫层析纸的制备中，得到的免疫层析纸特异性强，对阴性菌液均无检出情况，特异度可达100%，灵敏性较好，对幼虫芽孢杆菌的菌液及阳性样品最低检出浓度分别为105 CFU/mL和106 CFU/mL。

主权项

蜜蜂幼虫芽孢杆菌PLMP多抗的制备，其特征在于，具体采用以下技术步骤制备获得：(1)PLMP基因扩增:根据GenBank公布的幼虫芽孢杆菌核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物，并在引物的5'端分别加BamH I和EcoR I酶切位点识别序列，将幼虫芽孢杆菌阳性菌液DNA作为模板，进行PCR扩增，后回收目的片段备用；(2)原核表达载体pGEX‑4T‑1‑PLMP的构建：将上述PCR产物经胶回收纯化后与T载体连接，连接产物转化至DH5ɑ感受态细胞中，经培养基培养,摇菌复苏，复苏后离心弃上清液，菌泥混匀后培养12h；挑取单个菌落，经PCR鉴定为阳性菌落后摇菌培养，提取重组质粒；取pGEX‑4T‑1质粒和重组质粒分别用EcoR I和BamHI进行双酶切，酶切后用T4连接酶连接后转化至E.coliBL21感受态细胞，PCR筛选出阳性菌落后，挑取单个菌落培育；(3)PLMP重组蛋白的诱导表达及纯化:将重组菌pGEX‑4T‑1‑PLMP接种至培养基中，摇菌条件下培养至OD600nm达到0.4‑0.6之间，加入终浓度为0.2mmol/L‑1mmol/L的IPTG，在37℃200rpm摇菌诱导，诱导时间为1h‑8h，对重组蛋白采用切胶法纯化；(4)PLMP多克隆抗体的制备：取纯化的PLMP蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将乳化好的混合液对家兔背部皮下多点注射免疫；经四次免疫后，颈动脉采血，收集血清保存。