[发明专利]高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法

摘要

本发明公开一种高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3 蛋白的制备方法，采用不同的培养基对阳性重组子高密度发酵及IPTG诱导表达，以中空纤维滤膜过滤破碎菌体，代替现有的高速离心和死端过滤等操作，有效保证放大后工艺的合理性和可操作性，经镍离子亲和层析、阴离子交换层析及分子筛层析，可获得百克级的rLj‑RGD3原液，其蛋白纯度≥99%，适用于大规模工业化生产。将rLj‑RGD3原液与不同组分配合，通过冷冻干燥制备rLj‑RGD3蛋白，稳定性强。

主权项

一种高产量及高稳定性基因重组七鳃鳗Lj‑RGD3 蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a. 在Lj‑RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定，得到阳性重组子；b. 对阳性重组子扩大培养并进行IPTG诱导表达：b.1取单克隆，接种到LB培养基中，30℃培养16~18 小时，至OD600达到2~3；b.2按体积比1:10二级接种于高浓度培养基中，30℃培养2~3小时，至OD600达到1~2；b.3接种到中间转接发酵罐30℃继续培养，待发酵液OD600达到2~3左右时，向培养基中加入发酵体积1/20的微量元素、发酵体积2/5的葡萄糖、发酵体积1/100的Mg2SO4·2H2O、发酵体积0.2/100的CaCl2·2H2O及终浓度为1 mM的IPTG，30℃培养至OD至少为5；所述LB培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L；所述高浓度培养基的组分如下：胰蛋白胨12g/L, 酵母粉24 g/L，100%甘油4 ml/L，柠檬酸 7.5 g/L，NaCl 0.5g/L，KH2PO4 2.31 g/L，K2HPO4·3H2O 12.5 g/L，（NH4）2SO4 7g/L，H3PO4 1.5 ml/L，消泡剂0.6 ml/L；c. 收集菌体，经均质机破碎、中空纤维滤膜过滤得上清液；d. 所得上清液经镍离子亲和层析、阴离子交换层析及分子筛层析获得rLj‑RGD3原液。