[发明专利]一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，包括制备细胞裂解液，钉螺组织总RNA的粗提取，低浓度胍盐纯化钉螺组织总RNA，离心乙醇洗涤，DEPC水中溶解等步骤。本发明与现有技术相比，能够解决提取钉螺总RNA不完整、纯度低等问题，且使用本方法得到的钉螺总RNA不仅纯度高，而且方法简单经济，提取的总RNA能进一步满足RT‑PCR等分子生物学实验的要求。此外，本发明也可适用于其他小型软体动物的RNA提取。

主权项

一种简单经济钉螺组织总RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配置酚抽提液1：向一号1.5mL离心管中依次加入水饱和酚、氯仿和异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液1，待用；其中，水饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；(2)配置酚抽提液2：向二号1.5mL离心管中依次加入水饱和酚、氯仿和异戊醇，上下震荡混合均匀，得到酚抽提液2，待用；其中，水饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比为125:24:1；(3)制备细胞裂解液：在三号1.5mL离心管中配置1mL的裂解液，放入4℃冰箱内保存，待用；其中，细胞裂解液的成分为按体积比为2:1:1的步骤(1)所得的酚抽提液1、质量浓度为6％的SDS和2mol/L的醋酸钠；(4)钉螺组织总RNA的粗提取：取多只去除螺壳及消化系统的钉螺腹足肌肉共计40‑50mg，洗涤干净后并用滤纸吸去表面水分，置于玻璃研磨器中加入液氮研磨成粉末，迅速转移到步骤(3)所得的含有细胞裂解液的三号1.5mL离心管中，盖紧盖后上下颠倒离心管混匀，4℃放置5‑8min；(5)于4℃，12000rpm/min，离心10‑15min，得到第1上清液；(6)将步骤(5)离心后的第1上清液完全转移至四号2.0mL离心管中，向离心管中依次加入异硫氰酸胍溶液和醋酸钠缓冲液，然后再加入步骤(2)所得的酚抽提液2，盖紧盖后迅速在振荡器上充分震荡30s‑60s；其中，第1上清液、异硫氰酸胍溶液、醋酸钠缓冲液和酚抽提液2的体积比为1:0.9:0.1:2；(7)于4℃，12000rpm/min，离心10‑15min，得到第2上清液，将离心后的第2上清液完全转移至五号2.0mL离心管中，加入等体积异丙醇，盖紧盖后上下颠倒离心管至混匀，放置6‑10min；(8)于4℃，12000rpm/min，离心10min，弃去第3上清液，用体积浓度为70％‑80％的乙醇洗涤沉淀，重复洗涤2次，室温空气干燥5‑8min，溶解在20μL‑30μL DEPC水中低温保存。