[发明专利]一种肉葡萄球菌的电转化方法及其应用

摘要

本发明公开了一种肉葡萄球菌电转化方法，包括制备感受态细胞、电击转化和复苏培养三个步骤制备感受态细胞包括如下步骤将肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)ATCC 51365在LB培养基中活化后接种于生长培养基B2中，振荡培养至OD578为0.6，用GS电击缓冲液洗涤；电击转化包括如下步骤将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，进行电击；复苏培养包括如下步骤电击后迅速添加1mL LBM复苏培养基至电击杯中，混匀后全部取出并复苏培养4h，涂板培养过夜，得到导入质粒的重组肉葡萄球菌。采用本发明的方法，转化效率可达5.95×103CFU/μg DNA，极大地提高了肉葡萄球菌的转化效率。

主权项

一种重组质粒pBT2‑ET‑4C‑5R‑EGFP的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）穿梭载体pBT2‑ET‑5R‑EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其KpnI和NheI克隆位点之间插入一个tat‑egfp融合基因制备得到；该EGFP融合基因的启动子为肉葡萄球菌ATCC 51365的eftu基因的启动子序列（GenBank Accession No: 7551602），信号肽采用肉葡萄球菌ATCC 51365的efeB基因的tat信号肽序列（GenBank Accession No: AM295250），并在后续的EGFP基因（GenBank Accession No: AF302837）的N‑末端加入一个含有5个连续精氨酸序列（5R）的链接肽linker；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图11，如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列参照图12；如SEQ ID NO. 2所示；（2）穿梭载体pBT2‑ET‑4C‑5R‑EGFP：在质粒pBT2‑ET‑5R‑EGFP的基础上，根据tat信号肽和EGFP的氨基酸编码，依据密码子的偏好性，完成了4个密码子的同义突变，即139bp处和502bp处编码苯丙氨酸的TTC密码子替换为同义密码子TTT，403bp处和682bp处编码组氨酸的CAC密码子替换为同义密码子CAT，得到重组质粒pBT2‑ET‑4C‑5R‑EGFP；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图13，氨基酸序列参照图14。