[发明专利]一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法

摘要

本发明是一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法，包括外植体的选择与消毒、愈伤组织的诱导、不定芽的分化诱导以及壮苗生根等步骤。本发明以抽葶大青幼苗叶片为外植体，首次对抽葶大青的组织培养体系进行了探索，确立了无菌材料的获得、愈伤组织的诱导、不定芽的分化诱导、壮苗与生根等理想培养条件，最终成功建立了抽葶大青的无性繁殖体系，对抽葶大青药材资源的充分利用、遗传改良及无性系苗木的培育等提供一定的理论与技术依据。本发明的培养方法优点在于愈伤组织的诱导与不定芽的分化一步完成，操作简单，节省工作量的同时大大缩短培养的时间，可以在短时间里生产大量组培苗，不仅繁殖率高，而且苗的质量好，适合工厂化生产。

主权项

1.一种抽葶大青的组织培养与离体再生方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：(1)外植体的选择与消毒：选择抽葶大青幼苗叶片为外植体，洗净泥土，放入烧杯中，加入水和少量洗衣粉，轻轻摇晃5min，再用清水冲洗2h，将洗衣粉冲洗干净；最后转至超净工作台上，用75％(v/v)的乙醇溶液消毒3‑5s，无菌水洗2次，利用0.1％的含有吐温的升汞溶液消毒4‑5min，无菌水洗5‑6次备用；(2)愈伤组织的诱导：在无菌操作下，将消毒好的叶片剪成面积为1‑1.5cm²片状，以叶片正面向上的方式平放接种至愈伤组织诱导培养基中，温度23±2℃、空气相对湿度50％‑60％、光照强度2000Lx、光照时间12小时/天培养20‑25天，使叶片切口处均长出2‑6mm厚的一圈致密型、淡绿色、块状愈伤组织；(3)不定芽的分化：愈伤组织继续在上述培养条件下继续培养10‑12天，使愈伤组织上分化出深绿色、状态正常、数量极多的小芽；(4)芽的壮苗培养：分化出的不定芽连同愈伤组织及时切下，接入壮苗培养基中，温度23±2℃、空气相对湿度50％‑60％、光照强度2000Lx、光照时间12小时/天，培养天数25‑30天使苗高为3‑5cm；(5)生根培养：将步骤(4)培壮后的小苗单株切下，接入生根培养基中，温度23±2℃、空气相对湿度50％‑60％、光照强度2000Lx、光照时间12小时/天，培养20‑30天使幼苗生长3‑4条、长度为2‑4cm的不定根；所述愈伤组织诱导和所述不定芽的分化所用培养基配方为：WPM、MS或1/2MS培养基+TDZ 1.5‑2.5mg/L+NAA 0.1‑0.3mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L，所述培养基pH为5.8；所述壮苗培养基配方为：1/2MS或MS培养基+6‑BA 0.05‑0.2mg/L+NAA 0.02‑0.1mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L，所述培养基pH为5.8；所述生根培养基配方为：1/2MS培养基+NAA 0.5‑1.0mg/L+IBA 0.2‑0.5mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L，所述培养基pH为5.8。