[发明专利]一种优化的人脐静脉血管内皮细胞获取方法

摘要

本发明公开了一种脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的获取方法包括了细胞的原代分离、扩增、冻存方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：在室温下，用预热的I型胶原酶灌注脐静脉，消化收集得到HUVEC，然后进行培养扩增冻存，该方法不会造成过度消化组织，同时避免了环境和其它杂细胞的污染风险。本发明操作简单，安全，获得的细胞纯度较高，易于向临床用细胞的生产转化，可建立一种稳定的细胞分离、扩增及储存体系，为内皮细胞库的建设提供技术基础。

主权项

1.本发明主要是一种HUVEC的获取方法包括了原代分离、扩增及储存方法，其特征在于，包括了以下步骤：（1）原代分离：采集取足月新生儿脐带，使用Ⅰ型胶原酶灌注整个脐静脉，用脐带夹夹住两端端口；在15cm培养皿中，用预热的生理盐水浸泡整根脐带，消化35~45min，消化完后，将消化液及后续的清洗液一并收集于离心管，400g,离心8min；离完心后使用4mlHUVEC完全培养基重悬细胞沉淀，然后接种于1个T25中，置于5% CO₂饱和度的37℃培养箱中静置培养；（2）细胞扩增：细胞培养12‑24h后进行第一次全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织，以后每3天换液，直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代，细胞使用生理盐水洗涤2次，使用37℃预热的TrypLE消化细胞，细胞收集后离心、重悬、计数，按照1.1×10⁴/cm²接种至T175，按照25ml /瓶，加入完全培养基；（3）细胞冻存：配制冻存液，冻存液的成分为完全培养基+10%人血白蛋白+10%DMSO，4℃预冷备用，收集生长对数期的P3细胞进行冻存，细胞收集过程步骤同传代，离心完的细胞沉淀用冻存液重悬，调整细胞浓度为1×10⁶~1×10⁷/ml，将细胞悬液分装到冻存管里，转入‑80℃冰箱，次日转入液氮罐冻存。