[发明专利]竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法

摘要

本发明提供了竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法。包括竹叶花椒中期染色体载玻片标本的制备、荧光原位杂交、信号检测及载玻片回收步骤。本发明有助于建立稳定便捷的中期染色体荧光原位杂交反应体系，大大提高了竹叶花椒中期染色体的检出效率，为竹叶花椒染色体乃至花椒属物种染色体的检测提供新方法。

主权项

竹叶花椒中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：1)竹叶花椒中期染色体载玻片标本的制备：将竹叶花椒幼苗采用营养土培养，待根尖长至1.5～2.0cm时，剪取1～1.5cm根尖组织，依次用N2O处理3h、冰醋酸处理5min，然后置于75％酒精中于‑20℃保存；将低温保存的根尖组织以双蒸水清洗后切取根尖分生组织1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解55min，去除酶解液，依次用双蒸水、75％酒精、95％酒精、100％酒精清洗根尖分生组织后室温晾干；在根尖组织中加入冰醋酸制成悬浮液；将悬浮液滴于载玻片上室温晾干后镜检，镜检良好的玻片于‑20℃保存；2)荧光原位杂交：将载玻片置于4％多聚甲醛中处理10min，然后用2×SSC缓冲液处理两次，每次5min，再用双蒸水处理两次，每次5min，再依次用75％酒精、95％酒精、100％酒精梯度处理，每次5min，室温晾干后滴加70％FA液，盖上盖玻片，于80℃变性2min；载玻片变性完成后于5s内依次放入‑20℃的75％酒精、95％酒精、100％酒精梯度处理，每次5min，室温晾干；在晾干的载玻片上滴加放有探针的杂交液，盖上盖玻片，于黑暗条件下在杂交盒中于37℃恒温孵化1.5～2h；所述探针采用5S rDNA和(GAA)6，其中5S rDNA探针的碱基序列为：5′‑TCAGAACTCCGAAGTTAAGCGTGCTTGGGCGAGAGTAGTAC‑3′，采用FAM标记其序列的5’端；(GAA)6探针的碱基序列为：5′‑GAAGAAGAAGAAGAAGAA‑3’，采用TAMRM标记其序列的5’端；将孵化完成的载玻片在避光条件下依次用2×SSC缓冲液清洗3min、双蒸水处理两次，每次5min，室温晾干；3)信号检测：晾干后的载玻片上加入DAPI，盖上盖玻片，采用荧光显微镜对载玻片进行检测，采集检测图像；4)载玻片回收：之后回收制片并放入2×SSC缓冲液中于60℃水浴5min，依次在75％酒精、95％酒精、100％酒精中梯度处理，每次5min，处理完成后将回收制片于日光灯下放置12h；‑20℃保存。