[发明专利]一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞表达量影响的检测方法

摘要

本发明涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞表达量影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明采用生物化学及细胞学方法，利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了高内涵系统，可高通量检测多个样品对细胞AQP‑5表达量的影响，可快速准确可视的进行多样品检测，为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。

主权项

一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10‑20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2‑4×104个/mL细胞浓度接种于含有DMEM/F12细胞培养基的细胞培养板上，在37℃、5%CO2的条件下培养22‑26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2‑3d；步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4‑8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO2的条件下对细胞进行培养22‑26h；步骤（4），培养结束后弃上清，加入4%多聚甲醛室温固定细胞9‑11min，再用含有0.2% Tritonx‑100和1% BSA的PBS溶液使细胞膜通透；之后加入FITC标记的AQP5抗体至终浓度为100‑200μg/mL，室温避光孵育3‑4h后，用PBS洗涤细胞培养板2‑3次；接着再加入Hoechst染色液至终浓度为5‑10μg/mL，室温避光孵育10‑20min后，用PBS洗涤细胞培养板2‑3次；步骤（5），用高内涵成像系统对细胞进行扫描，选择FITC和Hoechst荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；步骤（6），使用高内涵分析软件中的Multi Wavelength Cell Scoring模块对图片进行分析，测量Hoechst通道中细胞核的平均直径，并用Hoechst通道中细胞核的平均直径值作为细胞核的直径参数；测量FITC通道中细胞质的平均直径，之后用FITC通道中细胞质的平均直径值作为细胞的直径参数；根据以上设置计算细胞核的Hoechst平均荧光值作为对照，同时计算细胞质的FITC平均荧光值，用FITC细胞平均荧光值表征该待检测样品的烟气对水通道蛋白5细胞表达量。