[发明专利]一种纯化培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基及使用方法

摘要

本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞的培养，具体涉及一种可长期培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基配方及其使用方法。首先通过机械离解制作大脑及脊髓细胞悬液，利用原代大鼠少突胶质前体细胞可在多聚赖氨酸包被的培养底物上快速贴壁的特点，获取富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞。在含有PDGF、Purmorphamine、N2添加剂及微量血清的培养基中培养，使少突胶质前体细胞大量增殖。5～6天后，撤除培养基中微量血清2～3天，使少突胶质前体细胞粘附力暂时降低，同时结合短暂机械震荡方式选择性分离、纯化少突胶质前体细胞。获得的细胞能够长期维持增殖能力，保持较高纯度，具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。

主权项

1.一种能够长期体外培养大鼠少突胶质前体细胞的培养基配方组成及其应用使用方法，其特征在于，通过机械离解方法制作大鼠大脑皮质及脊髓组织细胞悬液，利用少突胶质前体细胞可在多聚赖氨酸包被的培养底物上快速贴壁的特点，获取富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞；将获取的贴壁细胞在含有PDGF、一种嘌呤化合物Purmorphamine、N2添加剂及0.5％胎牛血清的特定培养基中培养，促使贴壁少突胶质前体细胞快速大量增殖；培养5～6天后，将培养基中微量血清短暂撤除2～3天，但仍然保留N2添加剂，PDGF以及Purmorphamine，使少突胶质前体细胞出现可逆性突起回缩、胞体变圆，与底物的粘附性明显降低，而其它非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁；结合轻柔机械震荡方法，使上述少突胶质前体细胞脱壁，从而获取较高纯度的细胞；获取的细胞可在上述培养基中连续传代培养数月，具有连续增殖能力，以及分化为成熟少突胶质细胞的能力；包括步骤：(1)新生大鼠大脑皮质及脊髓组织的获取和机械解离：无菌状态下分离新生小鼠大脑皮质或脊髓，通过纯机械解离方法制备细胞悬液并过滤；(2)细胞悬液中细胞的快速短暂粘附：将细胞悬液混匀后，置于涂布多聚赖氨酸的细胞培养瓶及培养板内；静置贴壁10～15分钟(室温25℃左右)，静置过程避免震动；静置结束后，轻轻倾斜培养瓶及培养板，吸除全部液体；(3)富含少突胶质前体细胞的贴壁细胞的培养：将培养基沿着培养瓶壁及板壁轻轻加入，避免对贴壁细胞的冲击；将细胞置于37℃、5％CO₂条件下静置培养；培养基每2天完全换液一次，换液前，适度手工摇晃震荡培养细胞，促使一些细胞碎片团块及死亡细胞脱壁；(4)利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性细胞培养5～6天后，大量少突胶质前体细胞增殖；将培养基中0.5％胎牛血清成分撤除后，继续培养2～3天后，少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁；与此同时，其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞形态无明显改变；(5)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞：将上述培养细胞在无菌操作台内轻轻震荡敲击，使大部分少突胶质前体细胞脱壁，绝大部分非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁；收集脱壁少突胶质前体细胞进行培养，换为含有0.5％胎牛血清的培养基；(5)少突胶质前体细胞的长期培养及诱导细胞6～8天传代一次，利用上述短暂血清撤除结合机械震荡方法分离细胞，按1:2或1:3进行传代；诱导分化时，将细胞培养基中的PDGF以及嘌呤化合物purmorphamine撤除，添加三碘甲状腺原氨酸(T3)，继续培养5～10天，每3天更换培养基一次，促使细胞分化成熟。