[发明专利]基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式DNA生物传感器

摘要

本发明利用血糖仪建立了一种基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携灵敏检测DNA的生物传感器，其制备方法是以纳米金功能化树枝状聚酰胺胺材料为载体，将蔗糖酶与信号核酸固定在此材料上，捕获核酸修饰的磁珠通过碱基互补配对与蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺结合，形成蔗糖酶修饰的磁珠。当靶DNA存在时，其与特异性的捕获核酸探针相结合，释放出蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺，经磁分离后，上清液中的蔗糖酶催化底物蔗糖，产生可检测的血糖信号，从而实现血糖仪对靶DNA的定量检测。该检测方法的线性范围是0.5pmol/L到1nmol/L，检测限为0.26pmol/L。结果表明，该方法在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

主权项

1.一种基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式DNA生物传感器，其制备方法包括以下步骤：(1)、纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的制备 将新鲜制备的HAuCl₄溶液(10ml，20mmol/L)与2ml超纯水加入12.5ml树枝状聚酰胺胺溶液中，此混合溶液搅拌1小时。然后将新鲜制备并储存于4摄氏度中的NaBH₄(500ul，1mol/L)迅速加入到上述溶液中，并充分搅拌反应30分钟。当溶液的颜色从浅黄色变为红褐色时说明纳米金功能化树枝状聚酰胺已经形成。在这个过程中，吸附于树枝状聚酰胺胺上的三化合价金离子被还原为零化合价的金原子。随后，透析除去杂质和游离的金纳米颗粒。最后将以上制备的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺分散于5ml超纯水中，并置于棕色瓶4摄氏度储存。(2)、蔗糖酶与DNA修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的制备 利用蔗糖酶上的半胱氨酸或赖氨酸残基与金纳米粒子间的相互作用，以及DNA上的巯基基团与金纳米粒子间的相互作用制备蔗糖酶与DNA修饰的纳米金功能化树状大分子。蔗糖酶(30ul，1.0mg/mL)加入到22ul纳米金功能化树枝状聚酰胺胺(稀释18倍，终浓度为0.048mmol/L)与178ul PBS(0.01mol/L，pH7.4)共200ul的混合液中，并于4摄氏度条件下孵育30分钟。随后10ul 1.0umol/L信号核酸(溶液含有10mmol/L Tris‑HCl，10mmol/L TCEP，0.1mol/L NaCl，pH7.4)加入到上述混合液中，并于同样的条件下孵育12小时(信号核酸与蔗糖酶加入量的体积比为1∶3)。(3)、捕获核酸修饰磁珠的制备 取30ul 4mg/mL的链霉亲和素磁珠溶液，用PBS缓冲液洗涤三次。然后将4ul 100umol/L的磁珠结合核酸加至上述磁珠溶液中，于37摄氏度下孵育30分钟，然后磁分离，洗去过量的磁珠结合核酸；紧接着4ul 100umol/L的捕获核酸加入磁珠中，并于37摄氏度下反应30分钟，磁分离，除去未结合的捕获核酸。最终将制备的捕获核酸修饰磁珠分散于120ul PBS溶液中。(4)、上述制备的磁珠溶液去除缓冲液后，加入60ul的蔗糖酶与DNA修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺，混合液于37摄氏度下反应30分钟。经磁分离后去除未结合的复合物(用PBS缓冲液清洗三次)，最后将功能化磁珠分散于60ul的PBS溶液中。取10ul此功能化磁珠溶液，经磁分离后加入10ul待检的DNA样品，并于37摄氏度孵育90分钟。磁分离后，取7ul上清液与3ul 2mol/L蔗糖(终浓度0.6mol/L)混合，并于37摄氏度孵育8小时。最终取2ul反应后的混合液用于血糖仪检测。这样就建立起基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式DNA生物传感器体系。