[发明专利]CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法

摘要

本发明提供了CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其能解决现有构建方法操作要求以及试剂配制要求较高受，普通技术人员获得的菌株阳性率低，阳性菌株挑选费时费力的技术问题。CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框（ORF）、启动子和终止子。

主权项

CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒，采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，所述sgRNA空质粒通过IIS型内切酶进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段，所述区分片段两端具有与IIS型内切酶酶切后对应的末端片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段连接，制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的sgRNA骨架载体转化大肠杆菌，涂抗性平板，形成单克隆，挑单克隆用含有所述IIS型内切酶酶切位点接头的引物进行菌落PCR鉴定；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框（ORF）、启动子和终止子，所述sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述步骤（4）还包括将PCR鉴定阳性的菌分别涂LB抗性板和含5%~10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%~10%蔗糖的LB抗性板上无法生长而在LB抗性板上形成菌苔，则表面该菌含有构建成功的重组sgRNA骨架载体。