[发明专利]一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法

摘要

本发明涉及饮用水领域，具体涉及一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法。本发明PCR扩增得到PPK、ADK基因，插入表达载体pET28a(+)中构建重组表达质粒pET28a(+)‑PPKADK，表达PPK‑ADK融合蛋白，利用表面包裹聚胺醇的磁珠，通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶固定于磁珠表面，制备固相腺苷酸双磷酸酶，用于除去与融合蛋白结合的内源性ADP，降低ATP扩增反应的背景，从而使之与生物发光反应相结合，可以快速有效的测定微量外源ATP及细菌菌落数，矿泉水中经过杀菌消毒，只含有微量的大肠杆菌。

主权项

一种矿泉水中微量大肠杆菌的检测方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：将大肠杆菌菌株接种至LB培养基中，培养，离心收集菌丝，向菌丝体中加入Tris‑HCl溶液，得菌丝混合液，将菌丝混合液与NaCl，EDTA按质量比2:50:1混合，置沸水浴，离心，取上清液加入NaAc，得上清液混合液，向上清液混合液中加入异丙醇，沉淀DNA，用体积分数为70%的乙醇水溶液洗涤沉淀2次，干燥，得大肠杆菌基因组DNA模板，将大肠杆菌基因组DNA模板溶于水，制成大肠杆菌基因组DNA模板水溶液；在90~94℃条件下将大肠杆菌基因组DNA模板水溶液变性，52~55℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ和大肠杆菌基因组DNA模板退火，然后在70~72℃条件下将引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ延伸，此过程重复30次，得处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液和处理后引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ，将处理后大肠杆菌基因组DNA模板水溶液、MgCl2、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、蛋白Marker、处理后引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ混合均匀后，得混合液，将混合液加入液体石蜡油覆盖混合液表面，得扩增的PPK、ADK基因；将扩增的ADK基因，插入质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+)‑ADK，将扩增的PPK基因插入重组质粒pET28a (+)‑ADK中，构建重组表达质粒pET28a(+)‑PPKADK，将重组菌进行诱导表达，收集菌液，离心，取沉淀菌丝体，超声破碎后，收集上清液，将上清液进行质量分数为12%的SDS‑PAGE电泳，得电泳产物，用镍亲和层析系统对电泳产物进行纯化，得洗脱液，将洗脱液用超滤膜进行超滤除盐，得融合蛋白PPK‑ADK；（4）取融合蛋白PPK‑ADK与polyP混合，得混合物A，将混合物A孵育，取孵育后混合物加入Beads‑apyrase 继续孵育，得去内源ADP融合蛋白产物；（5）将AMP，PolyP，MgCl2，Tris‑HCl，PPK‑ADK混合均匀，得微量ATP扩增反应液，将矿泉水与微量ATP扩增反应液混合，反应，得反应物，将反应物调节pH，向微量ATP扩增反应液中加入ATP，水浴，得反应液，将反应液加入生物发光反应液中，利用荧光反应，即可检测矿泉水中微量的大肠杆菌。