[发明专利]基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法

摘要

本发明基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，包括以下步骤：⑴设计连有醛基的DNA探针；⑵将氨基酸连接到DNA探针上；⑶制备气单胞菌溶素生物纳米通道：①活化气单胞菌溶素；②配制磷脂正癸烷溶液；③制备磷脂双分子层；④形成气单胞菌溶素生物纳米通道；⑷用气单胞菌溶素检测氨基酸：①采集DNA探针单分子信号；②采集氨基酸单分子信号；③采集DNA探针‑氨基酸单分子信号；④对采集到的DNA探针‑氨基酸单分子信号进行统计，得到氨基酸特征信息，基于此对不同的氨基酸同时进行检测。本发明能在单分子水平上同时对不同的氨基酸进行检测，且操作方便、实时准确，能实现超灵敏分辨，对生命科学研究具有非常积极的意义。

主权项

1.一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)设计连有醛基的DNA探针，所述DNA探针包含探针1和探针2；/n(2)将20μL、50μM～500μM、pH值为7.0～9.0的DNA探针1或者DNA探针2溶液与10μL、0.5mM～5mM、pH值为7.0～9.0的氨基酸溶液混合，70℃下置放10个小时以上，利用醛基与氨基的加成反应，将氨基酸连接到DNA探针上；/n(3)制备气单胞菌溶素生物纳米通道/n①活化气单胞菌溶素/n将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，在恒温箱内25℃下放置30分钟进行活化；活化后用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液进行稀释并在-20℃冰箱内保存；/n②配制磷脂正癸烷溶液/n在常温下将1，2-二植烷酰基磷脂溶于正癸烷溶液中，浓度为25mg/mL；/n③制备磷脂双分子层/n采用聚缩醛树脂检测池，所述聚缩醛树脂检测池含有cis检测池和trans检测池，在trans检测池上刻蚀直径为50nm的小孔，再用毫毛笔在所述小孔内外两侧均匀涂抹步骤(3)②配制的磷脂正癸烷溶液，用氮气吹干或让其自然晾干；/n将cis检测池与trans检测池进行组装，在cis检测池与trans检测池内分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入到电解质溶液中，通过电流放大器施加+100mV电压，指定cis检测池端为接地端；反复刷破和提拉磷脂膜，直到形成的磷脂膜能被400mV电压击破为止，此时的磷脂膜即为可允许气单胞菌溶素自组装并穿过的磷脂双分子层膜；/n④形成气单胞菌溶素生物纳米通道/n在形成稳定的磷脂双分子层膜后，在cis检测池中靠近磷脂双分子层膜附近注射3～5uL气单胞菌溶素溶液，施加100mV的跨膜电压，驱动气单胞菌溶素靠近磷脂双分子层膜并自组装嵌入膜上，当形成单个稳定的气单胞菌溶素生物纳米通道时，离子流在所述电解质溶液下发生50±5pA的台阶式上升；/n(4)用气单胞菌溶素检测氨基酸/n①采集DNA探针单分子信号/n在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入5～10μL、100μM DNA探针分子，DNA探针在电场力驱动下会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生单分子信号；/n②采集氨基酸单分子信号/n在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入10～20μL、1mM氨基酸溶液，分析其产生的单分子信号，由于其分子体积太小以至于不能引起纳米通道离子流的阻断信号；/n③采集DNA探针-氨基酸单分子信号/n在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入含有DNA探针-氨基酸的反应液，在电场力驱动下DNA-氨基酸会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生DNA探针-氨基酸单分子信号——这种信号是能反应氨基酸特征的单分子信号；/n④对采集到的DNA探针-氨基酸单分子信号进行统计/n对统计的阻断时间、阻断电流、阻断信号频率分别进行解析，得到氨基酸的特征信息，基于此能同时对不同的氨基酸进行检测；/n其中，步骤(4)④所述的能同时对不同的氨基酸进行检测包括以下步骤：/n(1)分别混合不同的氨基酸与DNA探针反应后的得到不同的DNA-氨基酸加合物单分子；/n(2)利用气单胞菌溶素纳米通道分别对不同的DNA-氨基酸加合物单分子进行分析；/n(3)统计各种DNA-氨基酸加合物单分子的阻断电流和阻断时间，对比不同DNA-氨基酸加合物单分子的阻断电流与阻断时间的差别，得到不同的DNA-氨基酸加合物单分子的特征信号；/n(4)将一个未知的氨基酸与DNA探针混合反应后，加入到cis检测池中，根据步骤(3)获得的不同的DNA-氨基酸加合物单分子的特征信号，能获知混合物中含有哪些氨基酸，进一步基于信号频率能定量体系中氨基酸的含量。/n