[发明专利]一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法

摘要

本发明提供了一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法。用传代培养、冻存复苏后培养的第三至第十二代的人尿液细胞作为滋养层细胞培养由成年男性包皮成纤维细胞重编的人多能干细胞(hiPS)。本发明使用的人尿液细胞代替传统方法中用的小鼠胚胎成纤维细胞或鼠胚成纤维细胞系，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，且比间充质干细胞更易获得。并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了hiPS细胞的生物学特性和多能干性，为hiPS进入临床应用提供了可能。

主权项

一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，该方法通过以下技术方案实现：(1)饲养层细胞的准备：用传代培养、低温冻存复苏后培养的人尿液细胞作为饲养层细胞，接种到用Matrigel处理后的六孔板上，细胞融合度80％左右，并用10μg/mL的丝裂霉素C处理1小时30分钟灭活，灭活后24‑48h内使用；(2)人诱导多能干细胞的获得：取成人23‑26岁的包皮成纤维细胞，用逆转录病毒感染两次，恢复培养期加入丁酸钠(NaBT)，感染6天时将细胞重新计数铺到用Matrigel处理过的培养板或培养皿上，更换为mTeSR培养基，每2天换液，直到出现胚胎干细胞状的克隆，挑选、扩增培养；(3)人诱导性多能干细胞的扩增培养：挑选类似胚胎干细胞的克隆，用Ⅳ型胶原酶消化8分钟，移液器吸头划成小块传到准备好的饲养层细胞上，每天换液，每5天传代一次；(4)人诱导多能干细胞的生物学特性和多能性的维持：在以尿液细胞为饲养层上扩增培养15代以后，用RT‑PCR法鉴定扩增培养后人诱导多能干细胞的多能标志表达情况，同时用拟胚体形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法检测其在体内外是否具有向三胚层分化的潜能。