[发明专利]一种应用斑马鱼毒性和代谢同步进程分析中药毒性作用新方法

摘要

本发明涉及一种用模式生物斑马鱼毒性评价和斑马鱼代谢同步进程法分析中药毒性作用的应用新方法，即用斑马鱼评价中药成分、组分或提取物的毒性过程中，同步动态分析代谢产物，评价中药及中药配伍毒性作用的同时，分析毒性的产生与成分变化的相关性，可发现中药中毒及配伍减毒的相关物质或原因。本发明克服现有斑马鱼毒性评价仅限于发现测试药对鱼形态、行为、死亡等毒性作用而未能同步分析测试药成分动态变化的缺陷，是一种操作方便、成本低、样品用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的斑马鱼毒性和代谢同步进程分析方法，可简单高效评价中药毒性同时发现代谢成分变化，发现致毒相关物质，亦可揭示中药配伍减毒的作用机制。

主权项

一种应用斑马鱼毒性和代谢同步进程分析中药毒性作用的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14‑12小时：10‑12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃‑30℃恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后1天1dpf斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基1‑2mL，每个孔里放6‑10条幼鱼，分为数组，溶媒阴性对照组和测试药物组，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃‑30℃恒温培养箱中培养，培养周期5‑7天，必要时隔1‑3天将每个孔里的溶液用移液枪吸出部分，再加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后3‑8天；步骤三：斑马鱼给药期间受精后1天到受精后8天，定时每天或隔天取药液和鱼体，药液吹干，鱼体匀浆后吹干，加溶剂溶解，高速离心或用微孔滤膜过滤后，取上清液或滤液，采用高效液相色谱或联用质谱技术分析代谢产物；步骤四：斑马鱼毒性评价：斑马鱼给药期间受精后1天到受精后8天，每天计数鱼死亡数量，用SPSS16.0软件计算各测试药给药后的动态斑马鱼半数致死浓度LC50。定时用显微镜观察主要脏器形态变化或斑马鱼行为变化；步骤五：斑马鱼毒性评价和斑马鱼代谢的相关分析：将斑马鱼毒性结果如死亡率或半数致死浓度LC50与经斑马鱼作用后的测试药成分代谢动态变化进行相关分析，分析致毒的相关成分。