[发明专利]一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆得到的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因扩增成为融合基因，再连接在载体的多克隆位点上，并将得到的重组质粒转化入DH5α，提取质粒并转入表达菌株中，经诱导培养得到重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌表达产生甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能同时分解甲酰胺生成NH4+和氧化亚磷酸盐磷酸盐成为磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物由于缺乏拥有这两条途径，无法在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中生长繁殖，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题。

主权项

1.一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物，PCR扩增含Linker序列的甲酰胺酶基因上游引物A1(5'‑CGCGGATCCGATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC‑3')，下划线斜体为BamH I酶切点；下游引物A2(5'‑CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGC‑3')，下划线为Linker序列；以类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的基因组为模板，克隆出1041bp的含Linker序列的甲酰胺酶基因序列for‑Linker；将克隆得到的基因序列for‑Linker连接到载体pMD‑19T Simple上，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pMD‑19T Simple‑for的重组大肠杆菌DH5α(pMD‑19T Simple‑for)；然后，以A1和B1(5'‑TATAACGAGTTTCGGCAGCATCGACCCACCACCGCCCGAGCCA‑3')扩增for‑Linker片段；(2)设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因上游引物B2(5'‑TGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGCTGCCGAAACTCGTTATA‑3')，下划线为Linker的部分DNA；下游引物B3(5'‑CCGGAATTCCGACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC‑3')，下划线斜体为EcoRⅠ酶切点；以肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列ptx，得到ptx片段；(3)重叠PCR扩增得到融合基因以步骤(1)、步骤(2)扩增得到的for‑Linker片段和ptx片段为模板，以A1和引物B3分别为上游、下游引物，扩增得到甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合基因for‑Linker‑ptx；利用BamHI和EcoRⅠ对融合基因for‑Linker‑ptx进行双酶切，连接入利用相同酶进行酶切的pGEX‑2T表达质粒，转化入DH5α，得到阳性克隆子DH5α(pGEX‑for‑Linker‑ptx)；(4)转化表达重组菌株从重组大肠杆菌DH5α(pGEX‑for‑Linker‑ptx)中提取重组质粒pGEX‑for‑Linker‑ptx，并将重组质粒pGEX‑for‑Linker‑ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX‑for‑Linker‑ptx)；(5)诱导培养重组大肠杆菌将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX‑for‑Linker‑ptx)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。