[发明专利]基于马血清胆碱酯酶农残速测卡及其生产工艺和使用方法

摘要

一种基于马血清胆碱酯酶的农残速测卡生产工艺，具体是利用盐析法将马血清中的胆碱酯酶析出、沉降，再经离心、复溶、透析步骤进行纯化，制得满足要求的胆碱酯酶，再根据所制备胆碱酯酶的活性，进行稀释，调节PH值、盐离子浓度，并加入稳定剂，制成农残速测卡酶工作液；将两个圆形滤纸片高温压合于一支持底板上，分别于两片滤纸片上滴加胆碱酯酶工作液、底物工作液，晾干后塑封，即制成农残速测卡。本发明制得的农残速测卡有较好的灵敏度、稳定性、重复性、再现性、简单、快速、直观、成本低，适用于瓜果蔬菜上农药残留的快速筛查。

主权项

1.一种基于马血清胆碱酯酶的农残速测卡生产工艺，其特征在于：包括如下步骤

S1、胆碱酯酶底物的制备：将靛酚钠溶解到有机溶剂中，搅拌反应液至澄清，在20～50℃下反应1～5小时后干燥、复溶，即获得胆碱酯酶底物、备用；

S2、马血清的制备：取马血于加有抗凝剂的离心瓶内，且使得抗凝剂浸润离心瓶内壁、离心，取上清后即获得马血清，2～8℃保存备用；

S3、马血清胆碱酯酶的制备：在步骤S2所获得的马血清中加入脱色剂，2～8℃磁力搅拌2～4h，一次离心后再于搅拌状态下加入硫酸铵直至浓度为40％～60％，2～8℃静置4～12h，二次离心、取上清，加入50％‑200％马血体积的缓冲液复溶，再2～8℃透析1h以上，即得马血清胆碱酯酶；

S4、农残速测卡的制备：将步骤S1制备的胆碱酯酶底物5μL‑50μL滴加于滤纸片上，于20℃‑37℃条件下风干，即获得底物片备用；于步骤S2制备的马血清胆碱酯酶中加入稳定剂，且稳定剂的用量为马血清胆碱酯酶体积的1％‑10％，混匀后取10μL‑100μL滴加于另一滤纸片上，于20℃‑37℃条件下风干，即获得马血清胆碱酯酶片，将所制备的底物片、马血清胆碱酯酶片在200‑300℃、5‑10个大气压的件下对称压合于一支持底板上，即获得农残速测卡。

2.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：步骤S1中，有机溶剂为乙酸酐与乙酰氯的混合液，且乙酸酐与乙酰氯的体积比为1:0.09～1:9。

3.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：步骤S1中，将反应1‑5小时后的反应液于50‑60℃条件下旋蒸干燥，并采用甲醇与丙酮的混合液作为复溶液复溶，且甲醇与丙酮的体积比为1:1～1:10。

4.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：优选地，步骤S2中，抗凝剂为浓度为20％的柠檬酸钠10ml。

5.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：步骤S2中，将离心瓶置于离心机上在2～8℃、200～300rpm条件下离心10～20min；

步骤S2中，将所取上清液过0.1‑0.45μm滤膜，即获得马血清。

6.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：步骤S3中，一次离心，具体是于2～8℃、4000～8000rpm条件下离心10min；二次离心，具体是于2～8℃、6000～10000rpm条件下离心20～40min。

7.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：步骤S3中，脱色剂为硅藻土，且每100ml马血清中添加0.5～3g的硅藻土；缓冲液为0.01‑1mol/L、PH值为6.0‑10.0的磷酸缓冲液。

8.根据权利要求1所述工艺，其特征在于：步骤S3中，稳定剂为含1％‑10％酪蛋白、0.5％‑5％蔗糖的水溶液。

9.保护权利要求1～8任一所述工艺制备的农残速测卡。

10.保护权利要求9所述农残速测卡的使用方法，具体为：将待检测样品滴加于马血清胆碱酯酶片，在20～37℃反应5～10min，再将底物片压合在马血清胆碱酯酶片上，20～37℃反应1～3min。若马血清胆碱酯酶片为深蓝色、或与空白对照卡相同，则表示为阴性；若马血清胆碱酯酶片为乳白色至浅蓝色、或颜色明显比空白对照卡浅，则判定为阳性；若空白对照卡的马血清胆碱酯酶片也为乳白色至浅蓝色，则农残速测卡失效。