[发明专利]一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用

摘要

本发明涉及一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用。使用两侧具有反应活性基团且连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，随后采用硼亲和材料对交联肽段进行选择性富集和高效释放。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质相互作用的分析。

主权项

1.一种用于交联肽段富集的方法，其特征在于：使用连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，将交联蛋白质样品进行酶解后，采用硼亲和材料选择性富集交联肽段，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息；具体包括：(1)对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于已提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂配制成溶液；(2)将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应；(3)对于细胞样品，离心弃去反应体系中的反应液，然后对细胞样品进行裂解，得交联蛋白样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品；(4)采用pH为1‑6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5‑14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原；(5)加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解，并将酶解产物进行除盐并冻干；(6)向步骤(5)的产物中加入带有硼亲和基团的富集材料；(7)使用洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段；(8)使用酸性溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析和数据检索。