[发明专利]一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法

摘要

本发明公开了一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法，具体步骤如下样品蛋白提取；采用Bradford法测定提取的蛋白浓度；蛋白酶解；iTRAQ标记；真空冷冻离心干燥；高pH条件下的反相色谱分离；ABI‑5600进行蛋白质分析；质谱数据分析在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现糖尿病肾虚中的特异性蛋白标记物，为糖尿病肾虚早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

主权项

一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于‑80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI‑TOF‑TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI‑5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对糖尿病肾虚证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，糖尿病肾虚证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；2)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonic anhydrase 1(Fragment)；3)检索号为P55000，基因注释为Secreted Ly‑6/uPAR‑related protein 1；4)检索号为Q96FQ6，基因注释为Protein S100‑A16；5)检索号为A8MSP2，基因注释为RAB37,member RAS oncogene family,isoform CRA_e；6)检索号为Q13748，基因注释为Tubulin alpha‑3C/D chain；7)检索号为P01771，基因注释为Ig heavy chain V‑III region HIL；8)检索号为H0YEY4，基因注释为ADP‑sugar pyrophosphatase(Fragment)；9)检索号为P02538，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6A；10)检索号为Q5JV98，基因注释为Serine/threonine‑protein kinase 24(Fragment)；11)检索号为O14929，基因注释为Histone acetyltransferase type B catalytic subunit；12)检索号为P33763，基因注释为Protein S100‑A5；13)检索号为Q5T8U5，基因注释为Surfeit 4；14)检索号为A0A087WYI3，基因注释为Folate receptor gamma(Fragment)；15)检索号为P27169，基因注释为Serum paraoxonase/arylesterase 1；16)检索号为P10599，基因注释为Thioredoxin；17)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；18)检索号为H0YM90，基因注释为Tyrosine‑protein kinase receptor；19)检索号为P04083，基因注释为Annexin A1；20)检索号为A0A0B4J1X8，基因注释为Protein IGHV3‑43(Fragment)；21)检索号为Q9NU63，基因注释为Zinc finger protein 57homolog；22)检索号为P07355，基因注释为Annexin A2；23)检索号为E7ENZ3，基因注释为T‑complex protein 1subunit epsilon；24)检索号为Q6P452，基因注释为Annexin；25)检索号为P19013，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 4；26)检索号为B0YJ81，基因注释为Very‑long‑chain(3R)‑3‑hydroxyacyl‑CoA dehydratase 1；27)检索号为P05387，基因注释为60S acidic ribosomal protein P2；28)检索号为P06702，基因注释为Protein S100‑A9；29)检索号为Q9UHG3，基因注释为Prenylcysteine oxidase 1；30)检索号为C9JTH1，基因注释为Interleukin‑36receptor antagonist protein(Fragment)；31)检索号为P12277，基因注释为Creatine kinase B‑type；32)检索号为P12724，基因注释为Eosinophil cationic protein；33)检索号为P13647，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 5；34)检索号为F5H3X6，基因注释为Prohibitin‑2(Fragment)；35)检索号为H7C5G1，基因注释为Isoamyl acetate‑hydrolyzing esterase 1 homolog(Fragment)；36)检索号为P49862，基因注释为Kallikrein‑7；37)检索号为P08727，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 19；38)检索号为A0A0A0MR85，基因注释为Glutathione S‑transferase Mu 4；39)检索号为E9PF10，基因注释为Nuclear pore complex protein Nup155；40)检索号为Q8N4H5，基因注释为Mitochondrial import receptor subunit TOM5 homolog；41)检索号为H0Y9H2，基因注释为Alpha‑adducin Fragment；42)检索号为P19652，基因注释为Alpha‑1‑acid glycoprotein 2；43)检索号为P01763，基因注释为Ig heavy chain V‑III region WEA；44)检索号为O43653，基因注释为Prostate stem cell antigen；45)检索号为P60985，基因注释为Keratinocyte differentiation‑associated protein；46)检索号为P31150，基因注释为Rab GDP dissociation inhibitor alpha；47)检索号为Q9NP55，基因注释为BPI fold‑containing family A member 1；48)检索号为P02760，基因注释为Protein AMBP；49)检索号为Q8IWV8，基因注释为E3ubiquitin‑protein ligase UBR2；50)检索号为Q8N1N4，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 78；51)检索号为E9PHK0，基因注释为Tetranectin；52)检索号为P05386，基因注释为60S acidic ribosomal protein P1；53)检索号为H0YF61，基因注释为Non‑specific lipid‑transfer protein Fragment；54)检索号为I3L397，基因注释为Eukaryotic translation initiation factor 5A Fragment；55)检索号为P01770，基因注释为Ig heavy chain V‑III region NIE；56)检索号为Q9NZH8，基因注释为Interleukin‑36gamma；57)检索号为I3L1E3，基因注释为Hepatocyte growth factor‑regulated tyrosine kinase substrate Fragment；58)检索号为P13646，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal13；59)检索号为Q14002，基因注释为Carcinoembryonic antigen‑related cell adhesion molecule 7；60)检索号为P26196，基因注释为Probable ATP‑dependent RNA helicase DDX6；61)检索号为P14854，基因注释为Cytochrome c oxidase subunit 6B1；62)检索号为Q13907，基因注释为Isopentenyl‑diphosphate Delta‑isomerase 1；63)检索号为Q8WWA0，基因注释为Intelectin‑1；64)检索号为P07099，基因注释为Epoxide hydrolase 1；65)检索号为F8VX90，基因注释为Receptor tyrosine‑protein kinase erbB‑3 Fragment；66)检索号为Q04695，基因注释为Keratin,type I cytoskeletal 17；67)检索号为Q7L523，基因注释为Ras‑related GTP‑binding protein A；68)检索号为A0A087X232，基因注释为Complement C1s subcomponent；69)检索号为D6RA82，基因注释为Annexin；70)检索号为P20851，基因注释为C4b‑binding protein beta chain；71)检索号为A0A0C4DH34，基因注释为Protein IGHV4‑28Fragment；72)检索号为Q9BV57，基因注释为1,2‑dihydroxy‑3‑keto‑5‑methylthiopentene dioxygenase；73)检索号为A0A0C4DG85，基因注释为Alcohol dehydrogenase class 4 mu/sigma chain；74)检索号为P05141，基因注释为ADP/ATP translocase 2；75)检索号为Q5VVC9，基因注释为60S ribosomal protein L11 Fragment；76)检索号为P02743，基因注释为Serum amyloid P‑component；77)检索号为A0A0G2JNI0，基因注释为Transmembrane protease serine 11E；78)检索号为H0Y764，基因注释为Neurobeachin‑like protein 2 Fragment；79)检索号为Q7Z6Z7，基因注释为E3 ubiquitin‑protein ligase HUWE1；80)检索号为Q8WWY7，基因注释为WAP four‑disulfide core domain protein 12；81)检索号为F8WE04，基因注释为Heat shock protein beta‑1；82)检索号为D6RF62，基因注释为Multifunctional protein ADE2；83)检索号为P00505，基因注释为Aspartate aminotransferase,mitochondrial；84)检索号为Q5VWK5，基因注释为Interleukin‑23 receptor；85)检索号为P41218，基因注释为Myeloid cell nuclear differentiation antigen；86)检索号为P35606，基因注释为Coatomer subunit beta'；87)检索号为Q5RHS7，基因注释为Protein S100‑A2；88)检索号为P15529，基因注释为Membrane cofactor protein；89)检索号为P08236，基因注释为Beta‑glucuronidase；90)检索号为Q8NFT8，基因注释为Delta and Notch‑like epidermal growth factor‑related receptor；91)检索号为P02768，基因注释为Serum albumin；92)检索号为A0A0A0MQY9，基因注释为Kallikrein‑8；93)检索号为P18510，基因注释为Interleukin‑1 receptor antagonist protein；94)检索号为C9J0E4，基因注释为Cystatin‑A；95)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin‑1；96)检索号为H7BZB9，基因注释为Microtubule‑associated protein 2 Fragment；97)检索号为Q99436，基因注释为Proteasome subunit beta type‑7；98)检索号为P30050，基因注释为60S ribosomal protein L12；99)检索号为Q14914，基因注释为Prostaglandin reductase 1；100)检索号为A6NNI4，基因注释为Tetraspanin；101)检索号为Q00610，基因注释为Clathrin heavy chain 1；102)检索号为D6RAW0，基因注释为Ubiquitin‑conjugating enzyme E2 D3 Fragment；103)检索号为Q5SYZ4，基因注释为Cellular retinoic acid‑binding protein 2 Fragment；104)检索号为Q3BDU5，基因注释为Prelamin‑A/C；105)检索号为Q5ST81，基因注释为Tubulin beta chain；106)检索号为P51993，基因注释为Alpha‑(1,3)‑fucosyltransferase 6；107)检索号为P13489，基因注释为Ribonuclease inhibitor；108)检索号为P59665，基因注释为Neutrophil defensin 1；109)检索号为P05109，基因注释为Protein S100‑A8；110)检索号为Q53RT3，基因注释为Retroviral‑like aspartic protease 1；111)检索号为H0YMS1，基因注释为Ammonium transporter Rh type C；112)检索号为A0A0A0MSZ3，基因注释为PI‑PLC X domain‑containing protein 1(Fragment)；113)检索号为B7Z5J4，基因注释为Carboxypeptidase A4；114)检索号为D6RBL5，基因注释为Annexin；115)检索号为O75506，基因注释为Heat shock factor‑binding protein 1；116)检索号为Q5TA02，基因注释为Glutathione S‑transferase omega‑1 Fragment；117)检索号为Q5W0J0，基因注释为Ras‑related protein Rab‑18；118)检索号为A2A3R7，基因注释为40S ribosomal protein S6；119)检索号为Q9UKR3，基因注释为Kallikrein‑13；120)检索号为A0A0A6YYA0，基因注释为Protein TMED7‑TICAM2；121)检索号为P23141，基因注释为Liver carboxylesterase 1；122)检索号为P22792，基因注释为Carboxypeptidase N subunit 2；123)检索号为P01861，基因注释为Ig gamma‑4chain C region；124)检索号为P33260，基因注释为Cytochrome P450 2C18；125)检索号为Q92747，基因注释为Actin‑related protein 2/3 complex subunit 1A；126)检索号为Q86T26，基因注释为Transmembrane protease serine 11B；下调蛋白如下：1)检索号为F1T0C9，基因注释为Homeobox protein OTX2；2)检索号为Q9P225，基因注释为Dynein heavy chain 2,axonemal；3)检索号为H0YA69，基因注释为Matrix metalloproteinase‑23(Fragment)；4)检索号为C9JEE0，基因注释为Immunoglobulin lambda‑like polypeptide 1(Fragment)；5)检索号为A0A0C4DG37，基因注释为Zinc finger protein 439；6)检索号为Q99592，基因注释为Zinc finger and BTB domain‑containing protein 18；7)检索号为Q70CQ2，基因注释为Ubiquitin carboxyl‑terminal hydrolase 34；8)检索号为C9JVB6，基因注释为Mitochondrial ribonuclease P protein 1(Fragment)；9)检索号为A0A0G2JN42，基因注释为Mucin‑6；10)检索号为P35609，基因注释为Alpha‑actinin‑2；11)检索号为Q9UBT3，基因注释为Dickkopf‑related protein 4；12)检索号为Q9Y2P5，基因注释为Bile acyl‑CoA synthetase；13)检索号为P02814，基因注释为Submaxillary gland androgen‑regulated protein 3B；14)检索号为F5H8E1，基因注释为Probable ATP‑dependent RNA helicase DHX37(Fragment)；15)检索号为M0R0W6，基因注释为Receptor protein‑tyrosine kinase；16)检索号为B7ZKW8，基因注释为CapZ‑interacting protein；17)检索号为E9PKW4，基因注释为Sulfotransferase；18)检索号为Q6ZWB5，基因注释为C3orf57protein；19)检索号为P53609，基因注释为Geranylgeranyl transferase type‑1 subunit beta；20)检索号为Q8IUE6，基因注释为Histone H2A type 2‑B；21)检索号为P02808，基因注释为Statherin；22)检索号为A0A087WW70，基因注释为WAS/WASL‑interacting protein family member 1；23)检索号为E9PBD8，基因注释为Lymphocyte‑specific protein 1(Fragment)；24)检索号为Q5T0V2，基因注释为Slit homolog 1protein；25)检索号为O75052，基因注释为Carboxyl‑terminal PDZ ligand of neuronal nitric oxide synthase protein ；26)检索号为Q8IUX8，基因注释为Epidermal growth factor‑like protein 6；27)检索号为P49789，基因注释为Bis(5'‑adenosyl)‑triphosphatase；28)检索号为K7EKQ0，基因注释为Kunitz‑type protease inhibitor 2(Fragment)；29)检索号为Q96FZ7，基因注释为Charged multivesicular body protein 6；30)检索号为O15287，基因注释为Fanconi anemia group G protein；31)检索号为P80217，基因注释为Interferon‑induced 35kDa protein；32)检索号为A6H8L4，基因注释为ADAM17 protein；33)检索号为P01705，基因注释为Ig lambda chain V‑II region NEI；34)检索号为F5H3P3，基因注释为Rho GDP‑dissociation inhibitor 2(Fragment)；35)检索号为H0YIY2，基因注释为Signal transducer and activator of transcription 6(Fragment)；36)检索号为P55957，基因注释为BH3‑interacting domain death agonist；37)检索号为H3BV17，基因注释为Phosphoglycolate phosphatase(Fragment)；38)检索号为G5E9R5，基因注释为Acid phosphatase 1,soluble,isoform CRA_d；39)检索号为G5E972，基因注释为Lamina‑associated polypeptide 2,isoforms beta/gamma；40)检索号为A0A075B6I0，基因注释为Protein IGLV8‑61(Fragment)；41)检索号为H0Y929，基因注释为PDZ and LIM domain protein 5(Fragment)；42)检索号为Q16836，基因注释为Hydroxyacyl‑coenzyme A dehydrogenase,mitochondrial；43)检索号为K7EP07，基因注释为Tubulin‑folding cofactor B(Fragment)；44)检索号为A0A0C4DGP4，基因注释为Glucosidase 2 subunit beta(Fragment)；45)检索号为J3QT83，基因注释为Collagen alpha‑1(XIV)chain(Fragment)；46)检索号为A0A0A0MS14，基因注释为Protein IGHV1‑45(Fragment)；47)检索号为H0Y7Z6，基因注释为Guanine nucleotide‑binding protein G(s)subunit alpha isoforms short(Fragment)；48)检索号为Q9UJ68，基因注释为Mitochondrial peptide methionine sulfoxide reductase；49)检索号为Q9NQP5，基因注释为Coagulation factor XIII A chain(Fragment)；50)检索号为Q14149，基因注释为MORC family CW‑type zinc finger protein 3；51)检索号为P18054，基因注释为Arachidonate 12‑lipoxygenase,12S‑type；52)检索号为A2A2D0，基因注释为Stathmin(Fragment)；53)检索号为Q3MHB9，基因注释为Short transient receptor potential channel 4；54)检索号为H7C200，基因注释为Arginyl aminopeptidase‑like 1(Fragment)；55)检索号为A0A087WTH9，基因注释为Conserved oligomeric Golgi complex subunit 3(Fragment)；56)检索号为A0A0B4J278，基因注释为Alpha‑1‑antitrypsin(Fragment)；57)检索号为Q6UXD5，基因注释为Seizure 6‑like protein 2；58)检索号为Q15404，基因注释为Ras suppressor protein 1；59)检索号为F8W148，基因注释为Carbonic anhydrase 6(Fragment)；60)检索号为P0C0S5，基因注释为Histone H2A.Z；61)检索号为Q01432，基因注释为AMP deaminase 3；62)检索号为Q9UIJ7，基因注释为GTP:AMP phosphotransferase AK3,mitochondrial；63)检索号为E7EVW7，基因注释为Hematopoietic lineage cell‑specific protein；64)检索号为Q96N76，基因注释为Urocanate hydratase；65)检索号为Q9NY15，基因注释为Stabilin‑1；66)检索号为Q5T0R9，基因注释为Adenylyl cyclase‑associated protein(Fragment)；67)检索号为B5MC59，基因注释为Replication protein A 14kDa subunit；68)检索号为P04208，基因注释为Ig lambda chain V‑I region WAH；69)检索号为Q92887，基因注释为Canalicular multispecific organic anion transporter 1；70)检索号为Q96T58，基因注释为Msx2‑interacting protein；71)检索号为G3V1B5，基因注释为Down syndrome cell adhesion molecule like 1,isoform CRA_a；72)检索号为Q7Z7M9，基因注释为Polypeptide N‑acetylgalactosaminyltransferase 5；73)检索号为Q5QPE4，基因注释为Sorting nexin‑5(Fragment)；74)检索号为H3BTU6，基因注释为Coronin(Fragment)；75)检索号为P02812，基因注释为Basic salivary proline‑rich protein 2；76)检索号为M0QZ70，基因注释为Intermediate conductance calcium‑activated potassium channel protein 4(Fragment)；77)检索号为Q86VR7，基因注释为V‑set and immunoglobulin domain‑containing protein10‑like；78)检索号为P27216，基因注释为Annexin A13；79)检索号为Q9P2G9，基因注释为Kelch‑like protein 8；80)检索号为H3BPR2，基因注释为Nucleoside diphosphate kinase；81)检索号为Q5VSN0，基因注释为SH3domain‑containing kinase‑binding protein 1；82)检索号为Q9ULZ3，基因注释为Apoptosis‑associated speck‑like protein containing a CARD；83)检索号为Q6NUS6，基因注释为Tectonic‑3；84)检索号为O00602，基因注释为Ficolin‑1；85)检索号为A0A0A0MTA3，基因注释为Protein IGKJ5(Fragment)；86)检索号为J3QL17，基因注释为ATP‑dependent RNA helicase DDX25(Fragment)；87)检索号为Q86SR1，基因注释为Polypeptide N‑acetylgalactosaminyltransferase 10；88)检索号为F8WF86，基因注释为NEDD8‑activating enzyme E1 catalytic subunit；89)检索号为O94769，基因注释为Extracellular matrix protein 2；90)检索号为Q5W0C6，基因注释为Torsin‑3A(Fragment)；91)检索号为P26022，基因注释为Pentraxin‑related protein PTX3；92)检索号为P01817，基因注释为Ig heavy chain V‑II region MCE；93)检索号为P08519，基因注释为Apolipoprotein(a)；94)检索号为P06213，基因注释为Insulin receptor；95)检索号为P35237，基因注释为Serpin B6；96)检索号为Q5T277，基因注释为Kynurenine‑‑oxoglutarate transaminase 1(Fragment)；97)检索号为P14598，基因注释为Neutrophil cytosol factor 1；98)检索号为O15067，基因注释为Phosphoribosylformylglycinamidine synthase；99)检索号为Q9H8J5，基因注释为MANSC domain‑containing protein 1；100)检索号为P05186，基因注释为Alkaline phosphatase,tissue‑nonspecific isozyme；101)检索号为O43598，基因注释为2'‑deoxynucleoside 5'‑phosphate N‑hydrolase 1；102)检索号为H3BPQ6，基因注释为Hepatoma‑derived growth factor‑related protein 3；103)检索号为H0Y4Y4，基因注释为EF‑hand domain‑containing protein D2(Fragment)；104)检索号为H0YN26，基因注释为Acidic leucine‑rich nuclear phosphoprotein32family member A；105)检索号为Q9Y6W5，基因注释为Wiskott‑Aldrich syndrome protein family member 2；106)检索号为Q01518，基因注释为Adenylyl cyclase‑associated protein 1；107)检索号为P30520，基因注释为Adenylosuccinate synthetase isozyme 2；108)检索号为Q9ULC6，基因注释为Protein‑arginine deiminase type‑1；109)检索号为H7BZI1，基因注释为Nucleobindin‑1(Fragment)；110)检索号为Q14332，基因注释为Frizzled‑2。