[发明专利]叶绿体基因组编辑方法

摘要

本发明提供了叶绿体基因组编辑方法。具体地，本发明提供了基于CRISPR技术的植物基因组定点编辑的核酸构建物、载体或载体组合、以及植物基因组定点编辑方法。本发明的核酸构建物包括式I核酸构建物和/或式II核酸构建物，所述式I核酸构建物包含叶绿体定位信号肽‑核酸酶表达盒，所述的式II核酸构建物包含ncRNA‑sgRNA表达盒。利用本发明的方法,可以将核酸酶和对应的sgRNA导入叶绿体，从而在预定的叶绿体基因组位点，简便而高效地进行基因敲除、或者同源重组和外源片段的定向插入。本发明方法可用于从叶绿体基因组水平改良作物的性状。

主权项

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物选自下组：

(1)式I核酸构建物：

X1‑X2‑X3‑X4‑X5      (I)

式中，

X1为启动子元件；

X2为叶绿体定位信号肽元件；

X3为核酸酶元件；

X4为无或标记基因元件；

X5为终止子；

(2)式II核酸构建物：

Y1‑Y2‑Y3‑Y4‑Ya‑Y5‑Yb‑Y6      (II)

式中，

Y1为启动子元件；

Y2为ncRNA元件；

Y3为无或标记基因元件；

Y4为无或RNA切割酶元件；

Ya和Yb各自独立地为无或RNA切割酶识别元件；

Y5为sgRNA元件；

Y6为终止子；

(3)包括式I构建物和式II构建物的构建物。

2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述式I核酸构建物中核酸酶元件X3选自下组：

(1)Cas9；

(2)Cpf1；

(3)锌指核酸酶；

(3)转录活化剂样核酸酶；

(4)巨核酸酶；

或其组合。

3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述式I核酸构建物中叶绿体定位信号肽元件X2为叶绿体信号肽infA。

4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述式II核酸构建物中ncRNA元件Y2来自类病毒。

5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述式II核酸构建物中RNA切割酶元件Y4为Csy4。

6.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述式II核酸构建物中sgRNA元件Y5为spCas9sgRNA。

7.一种载体或载体组合，其特征在于，所述载体或载体组合含有权利要求1‑6中任一所述的核酸构建物。

8.如权利要求7所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的式I核酸构建物和式II核酸构建物位于同一载体上。

9.一种试剂组合，其特征在于，包括：(i)权利要求7所述的载体或载体组合。

10.一种植物叶绿体基因编辑方法，其特征在于，包括步骤：

(i)将(a)权利要求7所述的载体或载体组合以及(b)任选的供体核酸片段，导入植物细胞、植物组织或植物，从而在所述植物细胞、植物组织或植物中产生基因编辑；和

(ii)任选地，对发生所述基因编辑的植物细胞或植物进行检测、筛选或鉴定。